[发明专利]一种监测细胞自噬的双光子pH比率计量荧光探针及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种监测细胞自噬的双光子pH比率计量荧光探针及其制备方法和用途，其中监测细胞自噬的双光子pH比率计量荧光探针的结构如下：本发明荧光探针能够对pH有专一性的荧光信号响应。本发明通过细胞共定位实验确信其能够专一性靶向细胞溶酶体，细胞毒性测试表明本发明对于细胞几乎没有什么毒副作用，双光子共聚焦荧光显微成像实验表明本发明对于MCF‑7细胞的渗透性良好，同时，经计算本发明荧光探针的pKa为3.88，非常适合细胞溶酶体pH变化范围的监测，能够通过检测细胞溶酶体pH的变化实时监测细胞自噬过程进行的情况。

技术领域

本发明涉及一种双光子比率型荧光探针，具体地说是一种监测细胞自噬的双光子pH比率计量荧光探针及其制备方法和用途。

背景技术

自噬是细胞在受到破坏性刺激时吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并内陷成囊泡进而与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程。细胞自噬是细胞成分降解和回收利用的基础，在细胞中起着“清道夫”的作用，作为细胞内细胞器和其它结构自然代谢的正常途径当组织细胞受到各种理化因素伤害时，自噬溶酶体大量增加，对细胞的损伤起一种保护作用。传统的自噬监测包括透射电子显微镜(TEM)，Western印迹(Atg8/LC3)和GFP-Atg8/LC3荧光显微镜。然而这些监测手段都有其局限性，如扫描电镜和蛋白免疫印迹，它们并不能监测活细胞里的自噬状态，同时，这些方法监测的结果可视化效果并不理想，因此，一种能够形象而又简易的监测自噬的方法对细胞自噬过程的研究十分必要。

溶酶体是真核细胞中一种单层膜囊状结构的细胞器，内含多种水解酶，在细胞中主要作用是分解从外界进入到细胞内的物质及消化细胞自身的局部细胞质或细胞器，当细胞衰老时，其溶酶体破裂，释放出水解酶，消化整个细胞而使其死亡。由于细胞微环境(如极性、pH、粘度)在溶酶体和自噬体中非常不同，所以当细胞发生自噬时两者融合形成的自噬溶酶体内的微环境势必发生变化，因此，我们可以通过检测该过程中细胞微环境的变化来监测细胞自噬发生的情况。

pH是细胞中生化反应平衡的重要影响因素，作为生物体系微环境中的一个重要性质，影响着细胞正常生命活动机制的运行以及生物分子的顺利转换。不正常的细胞pH变化与生物体系中多种疾病及生理过程有紧密的联系。

双光子荧光探针作为一种测试工具，当测试物质性质或所处环境发生变化时荧光信号就会发生相应改变，其灵敏度高，操作方便，稳定性高，光漂白性小，细胞穿透性强在细胞层面定性分析时展现出优越的性能。因此，可以选择双光子荧光探针通过检测细胞溶酶体内pH的变化来监测细胞自噬过程。

发明内容

本发明旨在提供一种监测细胞自噬的双光子pH比率计量荧光探针及其制备方法和用途。本发明通过分子设计遴选出一种合适的荧光探针结构，以实现双光子成像定性检测细胞溶酶体pH变化。本发明荧光探针专一性强，灵敏度高，细胞毒性实验表明本发明荧光探针对细胞几乎没有毒副作用。

本发明监测细胞自噬的双光子pH比率计量荧光探针(Lyso-MPBC)，简称为荧光探针，是以咔唑为母体，4-甲氧基苯乙炔为供电子基，溶酶体定位基团为吗啉，苯并咪唑为pH的响应基团，其结构式如下：

本发明监测细胞自噬的双光子pH比率计量荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

将化合物A1g、邻苯二胺0.46g、对甲苯磺酸0.0082g以及N,N-二甲基甲酰胺30mL加入到三口烧瓶中，在油浴锅中升温至120℃并通氩气保护反应12h；反应结束后将液体旋干，用二氯甲烷和水萃取，收集上层有机相并旋干得到粗产物；将所得粗产物制样用柱层析色谱柱分离，得到目标产物0.7g(1.28mmoL)，收率60％。

所述化合物A的结构式为：

柱层析色谱柱分离时所用洗脱液为二氯甲烷和甲醇按体积比100:1混合得到。