[发明专利]一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法

权利要求书

1.一种制备PD-1和LAG3敲除CD19 CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：

准备CD4+/CD8+ T细胞；

准备与用于敲除PD-1和LAG3基因的tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白；

将准备的tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白与电转试剂混合，加入CD4+/CD8+ T细胞中进行电转化；

准备CD19嵌合抗原受体慢病毒；

将准备的慢病毒用于感染电转化后的CD4+/CD8+ T细胞，antiCD3+CD28抗体激活T细胞扩增培养，通过荧光筛选实验以获得PD-1和LAG3敲除的CD19 CAR-T细胞。

2.如权利要求1所述方法，其中CD4+/CD8+ T细胞的获得是通过EasySeq试剂盒按说明书操作，制备而成。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述敲除PD-1和LAG3的sgRNA由tracrRNA和crRNA两部分组成，其中PD-1的crRNA靶向序列如SEQ ID No.1～2所示，LAG3的crRNA靶向序列如SEQ No.3～4所示。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述敲除PD-1和LAG3的Cas9蛋白为体外蛋白，羧基端有一个HA标签和两个核定位信号序列如SEQ No.5-6。

5.如权利要求1所述的方法，其中CD19 CAR是利用pCDH载体串联人EF1α启动子、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞外抗体结合区、铰链区、跨膜区胞内信号传导区和T2A短肽连接的筛选基因CopGFP制备而成，其中CSF2RA-CD19 scFv-CD8α -OX40-4-1BB-CD3ζ序列如SEQ No.7。

6.如权利要求5所述的方法，其中胞外抗原结合区为CD19单链抗体scFv FMC63，铰链区为CD8 Hinge，跨膜区为CD8α跨膜域，信号传导区为OX40-4-1BB-CD3ζ，其中OX40和4-1BB为共刺激因子。

7.一种用于制备PD-1和LAG3敲除CD19 CAR-T细胞的装置，包括

CD4+/CD8+细胞准备系统；

Cas9/RNP体外tracrRNA、crRNA和Ca9蛋白系统；

Amaxa电穿孔转化试剂盒；

用于激活T细胞的偶联CD3+CD28抗体磁珠；以及

筛选培养系统，用于筛选并培养转后的T细胞用以获得PD-1和LAG3敲除的CD19 CAR-T细胞。

8.如权利要求1～7之一所述的利用Cas9/RNP制备PD-1和LAG3敲除CAR-T的方法，以及获得的分离的T细胞或细胞系或其次代培养物。