[发明专利]一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法

说明书

本发明涉及一种Cas9/RNP制备PD‑1和LAG3双基因敲除CD19 CAR‑T细胞的方法，包括将用于敲除PD‑1和LAG3基因的sgRNA及Cas9蛋白与电转试剂混合，加入CD4+/CD8+细胞中进行电穿孔转化；采用CD19 CAR慢病毒转染CD4+/CD8+阳性细胞；以及筛选并培养扩增转染后的T细胞已获得PD‑1和LAG3双基因敲除CD19CAR‑T细胞。本发明选用Cas9/RNP基因编辑系统提高了转染效率和转基因的表达效率和时间，简化了CAR‑T细胞的制备流程，增加了系统的可行性和负载量。另外，本发明敲除PD‑1和LAG3双基因时避免使用转染试剂，安全性更高。

技术领域

本发明涉及免疫细胞制备领域，具体地，本发明涉及一种利用Cas9/RNP制备PD-1和 LAG3敲除的CD19 CAR-T细胞。

背景技术

继手术、放疗、化疗后，肿瘤的免疫疗法已成为行之有效的治疗方式，近期收到广泛关注。其中嵌合抗原受体T细胞技术(Cheimeric Antigen Receptors-T cell,CAR-T)是一种新出现的过继性细胞疗法(Adoptive cell transfer therapy,ACT)，该技术将患者T细胞在体外修饰、活化和增殖后回输到患者体内，通过T细胞表达的特异性受体，靶向性的识别肿瘤细胞，并显示较强的杀伤活性和持久性。

死亡分子-1(Programmed death-1,PD-1,也称为CD279)属于T淋巴细胞的抑制性共受体，是一种重要的免疫检查点，其配体(Programmed death ligand 1,PD-L1,也称为B7-H1 或CD274)可在多种肿瘤细胞表面表达。PD-1/PD-L1结合介导负性免疫调节通路，有利于形成肿瘤微环境，促进肿瘤免疫逃逸。

淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3,LAG-3)是一种重要的免疫检查点，主要表达于活化后的效应T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、B细胞及浆细胞样树突状细胞等，在调节T细胞免疫应答中发挥着十分微妙的作用。越来越多的证据表明，无论在体内还是体外，LAG-3都会负调控效应T细胞的功能(活化、细胞因子释放和细胞杀伤)，同时会增强调节性T细胞的免疫抑制功能。LAG-3还是T细胞耗竭的一个标志，在肿瘤和慢性感染环境中，LAG-3的表达会在T细胞表面明显上调，通过单克隆抗体阻断LAG-3，会增强 T细胞的增殖和细胞因子释放，而且会延迟细胞周期停滞，增加记忆T细胞亚型的比例。

在慢性感染和肿瘤的临床前研究发现，PD-1和LAG-3在促进免疫逃逸的过程中发挥协同作用，同时阻断PD-1和LAG-3信号通路可以逆转T细胞耗竭，提高T细胞抗感染和抗肿瘤的能力。目前单独使用LAG-3抗体或联合使用PD-1抗体和LAG-3抗体治疗血液肿瘤和实体瘤的临床试验正在进行(ClinicalTrials.gov,No.NCT02061761,NCT01968109)。

嵌合抗原受体(CAR)由胞外抗体结合区、铰链区、跨膜区胞内信号传导区等构成，一般通过病毒转导或电穿孔，使CAR分子表达在T细胞表面形成CAR-T细胞。CAR分子的设计根据胞内信号区的不同经历了四代发展，其中第一代信号区仅包含CD3ζ；第二代信号区在第一代基础上加了一个共刺激因子，如CD28、4-1BB、OX40等；第三代在第一代基础上加了两个串联的共刺激因子；第四代包含IL12、IL7、CCL19等能改善微环境的细胞因子。靶向血液肿瘤方向的CD19的CAR-T细胞，部分研究中总体缓解率达90％以上。然而在部分血液肿瘤及大部分实体肿瘤中由于肿瘤微环境的抑制，效果不是很理想，而免疫检验点是解除免疫抑制的关键环节之一，所以免疫检查点在T细胞上的敲除具有重要的临床应用价值。