[发明专利]甲鱼系统性败血症球状病毒RT-PCR检测引物及其检测方法

权利要求书

1.一种甲鱼系统性败血症球状病毒的RT-PCR检测引物，其特征在于由1对寡核苷酸引物STSSSV-F和STSSSV-R组成，序列如下：

STSSSV-F：5’-GGGACCTTACGTTGGTTTCTACAC-3’

STSSSV-R：5’-GCCCTCCACCAATATACATTTCTC-3’。

2.一种利用权利要求1所述的引物检测甲鱼系统性败血症球状病毒的RT-PCR方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)RT-PCR：

①RNA提取：取待测甲鱼血液或组织、粪便，按照Invitrogen Trizol LS说明书提取总RNA，用NanoDrop进行核酸定量；

②1st-cDNA合成：

1st-cDNA合成预处理体系包含RNA 1μg；100nM特异引物STSSSV-R 1μL；加RNasefreeH₂O至总体积4μL；

另取一PCR管设为阴性对照，其预处理体系中以1μL RNasefree H₂O代替RNA；

预处理体系混匀后，经72℃处理2min后冰上急冷2min；然后加入下列成分，混匀后为1st-cDNA合成体系：

取该1st-cDNA合成体系进行反应，反应温度及时间为：42℃1.5hour；然后75℃10min，即得到cDNA；

③PCR反应：

PCR反应体系如下：

反应温度及时间为：94℃预变性4min；94℃ 45s，60℃ 40s，72℃1min，34个循环；72℃10min，即获得PCR扩增产物；

(2)PCR扩增产物的鉴定：

取PCR扩增产物5μL，点样于1％琼脂糖凝胶，于0.5×TAE电泳缓冲液中电泳20min，用凝胶成像系统检查：结果阴性对照和阴性样品无目的条带；而出现约950bp目的条带的样品，表示该样品含有STSSSV。

3.一种如权利要求1所述的引物在检测甲鱼系统性败血症球状病毒上的应用。