[发明专利]甲鱼系统性败血症球状病毒RT-PCR检测引物及其检测方法

说明书

本发明涉及一种甲鱼系统性败血症球状病毒的RT‑PCR检测引物及其检测方法，其引物由正向和反向引物组成，正向引物及其寡核苷酸序列为：STSSSV‑F：5’‑GGGACCTTACGTTGGTTTCTACAC‑3’、反向引物及其寡核苷酸序列为STSSSV‑R：5’‑GCCCTCCACCAATATACATTTCTC‑3’。以该甲鱼系统性败血症球状病毒特异性引物组成的检测方法，是以待测样品的总RNA为模板进行RT‑PCR，对产物进行电泳判定结果。该方法快速、准确、灵敏、特异，适合甲鱼系统性败血症球状病毒的快速、准确检测。

技术领域

本发明涉及一种甲鱼系统性败血症球状病毒的引物及其检测方法，具体涉及甲鱼系统性 败血症球状病毒的RT-PCR检测引物及其检测方法，属分子生物学领域。

背景技术

甲鱼系统性败血症是近年来在浙江宁波、杭州等地乃至全国甲鱼生态养殖场发生的严重 的爆发性传染病，该病不断地在众多养殖场频繁爆发，造成严重损失。症状主要表现为系统 性出血性败血，死亡严重，发病时7-10天内累积死亡率可达90-100％。病鳖主要为体重 150-200g的幼鳖，成鳖也有患病感染。该病的原发性病原为甲鱼系统性败血症球状病毒 (Soft-shelled turtle systemic septicemia spherical virus，STSSSV)(保藏于中国微生物保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5378，保藏机构地址为：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏日期为：2011年10月21日。)

水产动物病毒是导致水产养殖大面积死亡从而造成巨大经济损失的最大隐患。如何快速 准确的预报和诊断水产动物疾病就成为了当前诊断技术的一大难点和重点，在现有的针对水 产动物病毒进行检测的方法中，应用较多的是病毒分离，组织病理及电镜观察等较为原始的 方法，这些方法耗费时间长，操作较复杂。且由于一些病毒在不同的组织中形态、大小可能 会出现一定的差异，容易导致错误的检测结果。核酸检测技术做为分子生物学检测技术的核 心，在病毒诊断中发挥着巨大的作用。本课题组率先分离、鉴定了STSSSV，测定了STSSSV 部分基因组序列，确定其为小RNA病毒(Picornavirus)，分析了其保守区域。在此基础上， 本发明设计了一对特异引物，建立了一种检测STSSSV的新方法，检测过程快速、准确、灵 敏、特异，这是首次建立一种针对STSSSV的核酸检测方法。

发明内容

本发明的目的在于针对目前甲鱼病毒检测技术的不足，提供一种检测甲鱼系统性败血症 球状病毒的RT-PCR检测引物及其检测方法，所述RT-PCR，是应用反转录PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)技术检测甲鱼系统性败血症球状病毒方法，对检测微量的样 品中的病毒的效果良好，具有快速、灵敏、特异性强的特点，可用于甲鱼系统性败血症球状 病毒感染的监测和甲鱼系统性败血症的分子流行病学调查等。

本发明的技术方案如下：

一种甲鱼系统性败血症球状病毒的RT-PCR检测引物，其特征在于由一对甲鱼系统性败 血症球状病毒STSSSV的特异性引物组成，该特异性引物及其序列为：

正向引物STSSSV-F：5’-GGGACCTTACGTTGGTTTCTACAC-3’

反向引物STSSSV-R：5’-GCCCTCCACCAATATACATTTCTC-3’

本发明利用甲鱼系统性败血症球状病毒(STSSSV)的RT-PCR检测引物，检测STSSSV的RT-PCR(反转录PCR)方法，其特征在于包括下列步骤：

1.RT-PCR：

(1)RNA提取：取待测甲鱼血液或组织、粪便，按照Invitrogen Trizol LS说明书提取 总RNA，用NanoDrop进行核酸定量。

(2)1st-cDNA合成(反转录)：