[发明专利]一种干细胞的保存方法

权利要求书

1.一种干细胞的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)干细胞原代培养：将干细胞转入完全培养基中进行培养，但细胞融合度达到80％以上时，往培养瓶中加入消化酶和生理盐水，让消化酶铺匀细胞面，当细胞变圆后，终止消化；

(2)干细胞传代培养：接种原代细胞进行培养，细胞密度达到80％以上，再次传代，传至第3-5代，收集细胞并计数；

(3)保存干细胞：取干细胞与所述保存液混合，置于培养箱中培养。

2.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述干细胞的浓度为1×10⁵-1×10⁷/ml，优选为5×10⁵-5×10⁶/ml，进一步优选为2×10⁶/ml。

3.根据权利要求1或2所述的保存方法，其特征在于，步骤(1)所述培养的温度为35-40℃，优选为36-38℃；

优选地，步骤(1)所述培养的CO₂的浓度为3-8％，优选为4-6％。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的保存方法，其特征在于，所述消化酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶或羧肽酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为胰蛋白酶；

优选地，所述消化酶的质量浓度为0.01-0.1％，优选为0.06-0.08％。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的保存方法，其特征在于，步骤(2)所述接种原代细胞的密度为6500-10000个/cm²，优选为7000-9000个/cm²。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的保存方法，其特征在于，步骤(3)所述保存液按重量份数包括如下组分：生理盐水5-15重量份、人血白蛋白3-6重量份和复方电解质注射液80-95重量份；

优选地，所述生理盐水的重量份数为6-10重量份，优选为9重量份；

优选地，所述人血白蛋白的重量份数为4-6重量份，优选为4重量份；

优选地，所述复方电解质注射液的重量份数为85-90重量份，优选为87重量份。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的保存方法，其特征在于，步骤(3)所述培养箱的温度为35-40℃，优选为36-38℃；

优选地，步骤(2)所述培养箱的CO₂的浓度为3-8％，优选为4-6％。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)干细胞原代培养：将1×10⁵-1×10⁷/ml干细胞转入完全培养基中在35-40℃、3-8％CO₂浓度下培养，但细胞融合度达到80％以上时，往培养瓶中加入质量浓度为0.01-0.1％的消化酶和生理盐水，让消化酶铺匀细胞面，当细胞变圆后，终止消化；

(2)干细胞传代培养：按接种密度6500-10000个/cm²接种原代细胞进行培养，细胞密度达到80％以上，再次传代，传至第3-5代，收集细胞并计数；

(3)保存干细胞：取干细胞与所述保存液混合，置于培养箱中35-40℃、3-8％CO₂浓度下培养；

其中，所述保存液按重量份数包括如下组分：生理盐水5-15重量份、人血白蛋白3-6重量份和复方电解质注射液80-95重量份。

9.如权利要求1-8之一所述的保存方法用于保存脐带间充质干细胞的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的浓度为1×10⁵-1×10⁷/ml，优选为5×10⁵-5×10⁶/ml，进一步优选为2×10⁶/ml。