[发明专利]一种荧光成像方法、实时差分超分辨显微成像方法及装置

权利要求书

1.一种荧光成像方法，其特征在于，将两种荧光材料结合制备成一复合荧光材料，复合荧光材料在双波长激光激发下产生两道主要光谱成分不重叠的荧光信号；所述复合荧光材料是发光纳米颗粒和/或标记物中两种材料的组合，该组合满足以下条件：两种材料的吸收光谱和荧光光谱都有不重叠部分，一种荧光材料的吸收光谱不与另一荧光材料的荧光发射光谱重合；

复合荧光材料的具体结构是两种稀土离子掺杂上转换纳米材料合成核壳结构，构筑三层核壳结构上转换纳米颗粒；

成像时，分别采用对应波长的双波长激光激发复合荧光材料，在一路，第一激光器产生稳定的第一波长激光，该激光经过准直后，经高倍物镜聚焦后获得聚焦的高斯型实心光斑，同时在另一路，第二连续激光器发出一稳定的第二波长激光，该激光经过准直后，再经过空间相位调制板调制形成空心光束，再经过二分之一玻片、1/4玻片形成右旋的圆偏振光，经高倍物镜聚焦后获得空心光斑，第一波长激光和第二波长激光通过二向色镜进行共轴耦合，经过扫描装置聚焦到样品上的空心光斑和实心光斑分别激发材料不同波段的荧光，这两个波段荧光在波长上可分离；通过带通滤光片，使用两个光电探测器对两部分荧光信号分开探测；扫描装置对耦合光斑进行XYZ扫描的同时，信号采集器记录这两部分信号，传输到计算机处理并显示两个通道的图像，将实心激光束激发的第二通道荧光图像和空心激光束激发的第一通道荧光图像相减即得到实时的超分辨图像。

2.根据权利要求1所述的荧光成像方法，其特征在于，两种稀土离子掺杂上转换纳米材料为两种能够自敏化自发光的稀土离子单掺杂，或者由一种敏化离子搭配一激活离子共掺杂构成。

3.根据权利要求1所述的荧光成像方法，其特征在于，所述复合荧光材料是两种荧光分子的一对一结合，所述荧光分子包括有机荧光染料分子、荧光蛋白和荧光素，结合方式可以通过将荧光分子修饰到互补单链DNA上再通过配对形成DNA双链实现，或通过将不同荧光分子分别修饰到一抗、二抗，生物素、链霉亲和素上，通过其特异性结合偶联结合成分子对。

4.根据权利要求1所述的荧光成像方法，其特征在于，所述复合荧光材料是发光纳米颗粒表面包覆有机荧光染料分子，所述发光纳米颗粒包括稀土掺杂上转换纳米颗粒、量子点、纳米金颗粒，包覆过程通过共价键结合、化学基团交联或静电吸方法实现。

5.一种实时差分超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

在一路，第一激光器产生稳定的第一波长激光，该激光经过准直后，经高倍物镜聚焦后获得聚焦的高斯型实心光斑；

同时在另一路，第二连续激光器发出一稳定的第二波长激光，该激光经过准直后，再经过空间相位调制板调制形成空心光束，再经过二分之一玻片、1/4玻片形成右旋的圆偏振光，经高倍物镜聚焦后获得空心光斑；

第一波长激光和第二波长激光通过二向色镜进行共轴耦合，保证聚焦后形成的所述高斯型实心光斑与所述空心光斑三维重合；

经过扫描装置聚焦到样品上的空心光斑和实心光斑分别激发材料不同波段的荧光，这两个波段荧光在波长上可分离；通过带通滤光片，使用两个光电探测器对两部分荧光信号分开探测；扫描装置对耦合光斑进行XYZ扫描的同时，信号采集器记录这两部分信号，传输到计算机处理并显示两个通道的图像，将实心激光束激发的第二通道荧光图像和空心激光束激发的第一通道荧光图像相减即得到实时的超分辨图像。