[发明专利]一种用于结肠癌高通量标记检测的探针试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种用于结肠癌高通量标记检测的探针试剂盒，其特征在于，包括生物素标记ND-1单抗、辣根过氧化氢酶标记抗体，以及链霉亲和素包被的酶标板体；

所述生物素标记ND-1单抗是利用生物素氨基乙酰肼通过糖链将单克隆抗体标记制备的；所述辣根过氧化氢酶标记抗体是采用戊二醛二步法标记单克隆抗体制备的。

2.根据权利要求1所述的一种用于结肠癌高通量标记检测的探针试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体是将稳定分泌单克隆抗体的细胞株通过扩大培养接种于小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠内增殖，从而得到大量含单克隆抗体的腹水；然后经真空冷冻干燥制备而成。

3.根据权利要求1所述的一种用于结肠癌高通量标记检测的探针试剂盒，其特征在于，所述生物素标记ND-1单抗在制备时，生物素氨基乙酰肼和单克隆抗体的分子比为200：1。

4.根据权利要求1所述的一种用于结肠癌高通量标记检测的探针试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化氢酶标记抗体的戊二醛二步法标记单克隆抗体的制备方法为：

称取辣根过氧化氢酶25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜，再经SephadexG-25层析柱用生理盐水洗脱，收集棕色流出液；

取12.5mg单克隆抗体用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入所述棕色流出液中，再加入0.25ml浓度为1M，pH值9.5的碳酸缓冲液，继续搅拌3h得溶液Ⅰ；

在所述溶液Ⅰ中加0.25ml浓度为0.2M的赖氨酸，室温下混匀静置2h，再边搅拌边逐滴加入10mL饱和硫酸铵溶液，4℃下静置1h得溶液Ⅱ；

将所得溶液Ⅱ在3000rpm下离心0.5h，取沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，再溶于浓度为0.15M，pH值7.4的磷酸缓冲液中得溶液Ⅲ；

将所得溶液Ⅲ装入透析袋中，用磷酸缓冲液缓冲液透析，去除铵离子后10000rpm离心30min去除沉淀，取上清液冷冻保存，即为辣根过氧化氢酶标记抗体。

5.根据权利要求1所述的一种用于结肠癌高通量标记检测的探针试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素包被的酶标板体的制备方法为：将链霉亲和素溶于pH值9.5的0.02M碳酸溶液中，浓度为10mg/L；然后加入96孔聚苯乙烯酶标板每孔100μL，4℃过夜；再用pH值7.4的0.01M吐温-20磷酸盐缓冲液洗3次，每次浸泡3min；最后加入100μL血清白蛋白4℃下静置过夜；按照上述方法重复3次后晾干即得。

6.权利要求1～4任一项所述用于结肠癌高通量标记检测的探针试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、用50mM的2-[N-吗啡啉]-乙磺酸缓冲液分别将生物素标记ND-1单抗、辣根过氧化氢酶标记抗体稀释，再混合得混合液Ⅰ备用；

S2、在所述链霉亲和素包被的酶标板体中每孔加入50μL待测样品，然后加50μL混合液Ⅰ，37℃下孵育2h，然后用0.02M的Tris-吐温洗涤；

S3、加2，2-连氮基-二[3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6]铵盐底物液，在37℃下显色30min，再用2M硫酸终止反应；

S4、测405nm吸光度值，以CCL187细胞培养上清液为阳性对照，以健康人血清为阴性对照，最终诊断结肠癌。