[发明专利]一种快速准确鉴定越橘属植物的检测方法

权利要求书

1.一种快速准确鉴定越橘属植物的检测方法，其特征在于，使用如下5个SSR位点的引物对组合进行检测，所述引物对组合的核苷酸序列如下：

VcSSR11-F和VcSSR11-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、2所示；

VcSSR14-F和VcSSR14-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、4所示；

VcSSR19-F和VcSSR19-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5、6所示；

VcSSR28-F和VcSSR28-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7、8所示；

VcSSR33-F和VcSSR33-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9、10所示。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述越橘属植物来自如下：伯克利、蓝丰、布里吉塔、艾克塔、埃利奥特、泽西、瑞卡、安娜、比洛克西、蓝雨、绿宝石、奥尼尔、薄雾、盛世、莱克西、珍珠、海岸、杜克、奥扎克蓝、夏普蓝、明星、蓝美人、蓝宝石、贵蓝、霍利斯特、麦克法林、贝恩、史蒂文森、苍山越橘、乌鸦果、江南越橘、云南越橘1、云南越橘2、云南越橘3、无梗越橘1、无梗越橘2、乌饭树1和乌饭树2。

3.越橘属植物等位基因图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：越橘属植物DNA的提取；

步骤2：基因组中简单重复序列位点分析，包括如下步骤：

步骤2.1 PCR扩增：

以步骤1提取的DNA为模板，使用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；

步骤2.2 电泳检测：

取上述扩增产物电泳，紫外灯下拍照记录结果；

步骤2.3 SSR基因分型和Gene Mapper软件统计：

选取上述PCR产物与变性剂和内参混匀，使用PCR仪在95 °C下变性5min，取出立即放置冰上，然后放入遗传分析仪进行分析，同时使用Gene Mapper软件读取片段长度；

步骤3，遗传多样性分析和等位基因图谱构建

将Gene Mapper统计得到的等位基因长度数据输入Excel，根据特异等位基因长度构建其等位基因图谱。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述越橘属植物来自如下：伯克利、蓝丰、布里吉塔、艾克塔、埃利奥特、泽西、瑞卡、安娜、比洛克西、蓝雨、绿宝石、奥尼尔、薄雾、盛世、莱克西、珍珠、海岸、杜克、奥扎克蓝、夏普蓝、明星、蓝美人、蓝宝石、贵蓝、霍利斯特、麦克法林、贝恩、史蒂文森、苍山越橘、乌鸦果、江南越橘、云南越橘1、云南越橘2、云南越橘3、无梗越橘1、无梗越橘2、乌饭树1和乌饭树2。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2.1PCR扩增具体为：

以步骤1提取的DNA为模板进行PCR扩增；

20μL反应体系包含：TaKaRa Premix rTaq™ 10 μL、正向引物0.1 μL，反向引物0.5 μL，荧光修饰的M13引物0.4 μL，10 ng DNA模板，剩余体积使用双蒸水补齐；

反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30个循环后，改变循环条件为94 ℃变性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，进行8个循环，最后72 ℃延伸 8 min。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，在所述正向引物的5'端统一加18 bp的M13序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述荧光修饰的M13引物为5’端分别使用Fam和Hex两种荧光基团修饰的M13引物，其中M13引物的序列为5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1的DNA提取包括如下步骤：

步骤1.1 配制DNA提取液：2% CTAB，0.1 M Tris，20 mM EDTA，1.4 M NaCl，pH 8.0；DNA溶解缓冲液：10 mM Tris；1 mM EDTA；pH=8.0；

步骤1.2 对越橘属植物材料进行如下处理：

①在1.5 mL离心管中加入400 μL的DNA提取液和8 μL β-巯基乙醇，放置在65 °C水浴中预热 15 min；

②取0.1 g的蓝莓品种及其近缘种材料的新鲜叶片，在研钵放入少许聚乙烯比咯烷酮K30，加入液氮充分研磨；将研磨好的叶片转移至含DNA提取液的离心管中，混匀后放入65 °C水浴锅中水浴30 min，每隔10 min摇匀一次，使叶肉细胞充分裂解；

③水浴结束后，取出离心管冷却至室温；加入400 μL预冷的体积比为24 : 1的氯仿/异戊醇混合溶液，充分混匀后在10 000 rpm下离心15 min；

④用移液器小心吸取上清液，转移至新的1.5 mL离心管中，加入400 μL的异丙醇和40μL的3M的醋酸钠溶液，轻轻颠倒混匀，静置15 min至产生絮状沉淀，然后在10 000 rpm下离心10 min；

⑤离心后弃上清液，将底部白色沉淀即粗提DNA小心取出，转入1.5 mL离心管中，加入700 μL 70%的乙醇洗涤两次；离心后弃乙醇，用移液器吸干剩余乙醇，将白色沉淀物收集在离心管侧壁上，放入37 °C鼓风干燥箱中烘干；

⑥加入500 μL DNA溶解缓冲液将烘干后的DNA重新溶解，使用移液器吸打混匀，待完全溶解后加入1 μL RNase，用移液器轻轻吸打DNA溶液，混匀后将离心管放入37 °C保温箱中保温1 h，降解提取液中的RNA；

⑦取4 μL DNA溶液在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，检测其完整性；取一半DNA溶液，将其稀释至20 ng·μL ^-1用于后续的PCR反应，剩余部分置于-20 °C保存。