[发明专利]一种用于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的方法

权利要求书

1.一种用于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的方法，其特征在于：所述鉴定方法如下：

步骤一：选取药用牡丹和油用牡丹作为验证样本；

步骤二：选择仪器与试药，NAS-99分光光度计、BC-subMIDI电泳槽、BG-Power300C电泳电源、1-14离心机、Verity PCR仪、凝胶成像仪、DHP-9052恒温培养箱、摇床、3730xl基因分析仪、HiSeq2500，内切酶HaeIII(NEB R0108M)、Hi-Di去离子甲酰胺、POP-7胶、10×Buffer(4311320)、Platinum taq酶(Thermo，10966026)；

步骤三：引物设计与多态性引物筛选，采用改良CTAB法提取样品DNA，凝胶电泳检测质量，对合成的44对不同引物进行扩增，

步骤四：将步骤三所述的44对不同引物进行扩增，TP-M13-SSR扩增反应体系为10μL，降落扩增程序；

步骤五：将步骤四所述的不同引物进行扩增，降落扩增程序后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，挑选有目的条带的产物上3730xl基因分析仪检测后进行数据分析；

步骤六：通过不同来源的随机两份验证样本进行再次扩增后进行测序，筛选后获得6对具有多态性引物；

步骤七：将步骤六所述筛选后获得5对多态性引物TP-M13-SSR所检测的不同药用牡丹和油用牡丹栽培种质在不同SSR位点的多态性原始数据；

步骤八：观察验证原始测序峰图可以看出，利用筛选的SSR引物对20份不同种质材料进行扩增后测序，获得不同位点的等位基因片段大小。

2.根据权利要求1所述的一种用于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的方法，其特征在于：所述步骤四中，TP-M13-SSR扩增反应体系为10μl，包括primers(5uM)各0.3μl、10×PCRBuffer 1μl、dNTP(10mM)0.8μl、Taq酶(5U/ul)0.12μll、DNA模板1μl以及ddH₂O 6.48μl。

3.根据权利要求1所述的一种用于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的方法，其特征在于：所述步骤四中，降落扩增程序：95℃预变性2min；95℃变性30s，起始退火62℃30s，10个循环，其中每个循环下降1℃；94℃再次变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种用于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的方法，其特征在于：所述步骤六中，基于二核苷酸重复序列开发的引物C77878可以较好地区分两种栽培牡丹，不同产地药用牡丹扩增后等位基因长度约为169bp、171bp、173bp、175bp或177bp，二核苷酸重复次数为4-5次，而油用牡丹扩增后等位基因长度约为169bp和171bp，二核苷酸重复次数为1-2次。