[发明专利]一种快速响应的一氧化氮的近红外探针及其制备和生物应用

说明书

本发明涉及一种快速响应的一氧化氮的近红外探针及其制备和生物应用，结构如式(Ⅰ)所示，属于有机荧光探针领域。本发明设计并合成了一类快速响应的近红外一氧化氮探针。该探针与NO响应后具有近红外发射。体外实验研究表明，探针与NO反应速度快。在生理条件(pH 7.4)下,探针稳定，且对NO具有较高的灵敏度、选择性和抗干扰性。生物实验研究表明，探针不仅可以应用于细胞中内源性NO水平的检测，还可以应用于PD细胞和果蝇脑模型中NO水平的检测。这些结果表明，该探针具有较高的特异性、选择性、稳定性，将来可能应用于帕金森病的早期诊断。

技术领域

本发明涉及一种快速响应的一氧化氮近红外探针及其制备方法和生物应用，属于有机荧光探针领域。

背景技术

一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是由一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthetase,NOS)合成的细胞信使分子，它在心血管、神经和免疫系统中起着重要的作用。NO的作用取决于细胞微环境中NO浓度以及时间和空间的分布。NO的异常产生与许多疾病的发病过程有关，如癌症、内皮功能障碍和神经退行性疾病。越来越多的研究表明，NO在常见的神经退行性疾病-帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的发病机制中起了关键作用。但是生物体内NO检测的方法仍有待提高。目前，检测PD中NO水平的主要方法是蛋白质印迹法检测一氧化氮合成酶的表达量，这种方法不能直接、实时监测活细胞中NO的水平。因此，设计一种实时检测活细胞中NO水平的探针对研究NO在PD中的作用具有重要的意义。

NO荧光探针具有灵敏度高、选择性高、时空分辨率高、实验方便等优点，已被开发并应用于细胞和生物体中NO的成像，让我们对NO在细胞和生物体中的功能有了更多的认识。目前报道的NO荧光探针主要有两种不同的类型，一种是Nagano课题组开发的基于邻苯二胺结构的反应型一氧化氮探针，另一种是Lippard课题组报道的金属离子络合物一氧化氮探针。在NO荧光探针中，使用邻苯二胺作为NO捕获基团是最普遍的方法。其原理是，邻苯二胺作为反应位点来调节光诱导电子转移(PET)过程，探针的荧光团处于猝灭状态直至其与NO反应，阻断PET过程，使荧光团恢复荧光来反映NO的水平。这一类型探针具有灵敏度高、pH稳定并且可用于生物体内外的NO成像等优点。然而，这一类型探针还存在一些局限性。例如，短激发波长使探针具有穿透深度浅、光损伤大和细胞自发荧光强的缺点。基于邻苯二氨为NO识别基团的荧光探针容易受到谷胱甘肽等氧化剂的干扰。而且这些已经发表的NO荧光探针中没有一种被进一步应用于帕金森病模型中NO的检测。

为了解决以上问题，有必要开发一种新型一氧化氮探针。本发明以邻苯二胺作为NO识别基团，设计合成了一类快速响应的近红外一氧化氮探针。该探针与NO响应后具有近红外发射，因此具有组织穿透能力强、光损伤弱和受组织自发荧光影响弱等优点，且反应后荧光量子产率显著增高。体外实验研究表明，探针与NO反应速度快。在生物条件(pH 7.4)下,探针稳定，且对NO具有较高的灵敏度和选择性，不受其他离子和氨基酸的干扰。生物实验研究表明，探针对细胞毒性低，且可以检测细胞中外源和内源性NO的水平。进一步将探针应用于PD细胞模型中，实验结果表明探针可以直观地显示出PD细胞模型中内源性NO水平。此外，鉴于探针与NO反应后的荧光发射处于近红外区，具有较强的组织穿透能力，因此我们进一步将探针应用于PD果蝇脑模型，实验结果表明，探针可以反映出PD果蝇脑中NO的水平。这些结果表明，该探针具有较高的特异性、选择性、稳定性，将来可能应用于帕金森病的早期诊断。

发明内容

为了解决以上的问题，本发明利用邻苯二胺作为NO捕获器，提供一种灵敏性高、特异性强、反应速度快的近红外NO探针，该探针不仅可以检测生物体内的NO的含量，还可以检测PD细胞模型和PD果蝇脑模型中NO的含量。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：一种快速响应的一氧化氮的近红外探针，所述的荧光探针为BT-NH荧光探针，其结构如Ⅰ所示：