[发明专利]利用黑鲨鱼皮分离纯化抗氧化多肽

说明书

本发明提供了一种利用黑鲨鱼皮分离纯化抗氧化多肽的方法，该方法以黑鲨鱼皮为原料，通过碱性蛋白酶的酶解，分离纯化得到特异性抗氧化多肽，其分子量在344 Da，其氨基酸全序列为：Tyr‑Tyr。本发明消除了天然抗氧化剂所具有的缺陷并且消除了公众对人工合成抗氧化剂的忧虑，为开发基于食品源的抗氧化多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定理论基础。

技术领域

本发明提供了一种利用黑鲨鱼皮分离纯化抗氧化多肽的方法，更具体地涉及了一种黑鲨鱼皮抗氧化多肽，属于生物技术领域。

背景技术

氧化在人体生命运转中无处不在。在人体细胞新陈代谢过程中，产生自由基和其它活性氧物质，当有过多的自由基生成时，自由基对细胞保护酶，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶造成损害，甚至引起细胞凋亡，如氧化细胞蛋白质、膜脂质等。

在食品中，食品营养成分的氧化会产生过氧化物，其不仅会影响食品的营养价值，引起食品品质下降，严重的甚至还会导致摄入者的身体发生疾病。因此，寻找安全的抗氧化剂以抑制过氧化物产生一直是生化营养学的研究热点。由于BHT、TBHQ等化学合成抗氧化剂比天然抗氧化剂具有更好的效果和更便宜的价格，因此其已经被广泛应用于食品行业中。

但是，目前有研究发现合成抗氧化剂对人体肝、脾、肺等器官具有蓄积性致癌作用，从而引起了人们对其安全性的担忧，并且开始逐渐限制其在食品中的使用。于是人们把目光转向天然抗氧化剂。α-生育酚是一种被最普遍使用的天然抗氧化剂，它能有效保持食品中油脂的稳定性，但是却不利于食品保存。因此，我们有必要寻找一种其它来源的安全的天然抗氧化剂。

由于近些年来口蹄疫、疯牛病等传染性疾病频发，陆生动物安全日益严重，因此，陆生动物蛋白及其蛋白制品的安全性受到破坏；此外，由于世界各地有较多宗教信仰者，陆生动物蛋白不被其接受。因此，通过海洋鱼类制得的抗氧化肽产品具有更广阔的市场前景。黑鲨鱼皮由于其形状和厚度不均匀，难以作为高附加值产品（如皮革制品）加工利用。研究显示，鱼皮中蛋白含量高，种类丰富，特别是胶原蛋白含量高（60～80%），是鱼皮蛋白主要成分。在鲨鱼生产加工过程中，产生大量的下脚料，这些下脚料除少部分用于饲料加工，大部分以废弃物形式丢弃，这不仅会造成环境污染，还引起资源浪费。因此，如何从鱼皮中获得具有特定氨基酸序列的高效抗氧化多肽就成为迫切的研究方向。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用黑鲨鱼皮分离纯化抗氧化多肽的方法，使抗氧化活性得以高效地实现。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

本发明的一种抗氧化多肽，氨基酸序列为Tyr-Tyr（YY）。

本发明提供了一种抗氧化多肽的制备方法，以黑鲨鱼皮为原料，采用碱性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽；所述酶解条件为：pH为7.0~9.0、温度40~50℃、酶解时间为4.0~6.0h、底物浓度为2.0~4.0%，酶添加量为9.0~10.0 wt.%。优选的，酶解条件为pH为8.0、温度45℃、酶解时间为4.9h、底物浓度为3%，酶添加量为9.6wt.%。所述分离纯化的手段RP-HPLC反相高效液相色谱。

所述分离纯化的具体步骤为：

利用RP-HPLC反相高效液相色谱分离酶解产物，并监控分离组分的抗氧化活性，收集具有最佳抗氧化活性的组分；反相HPLC的分离以含体积分数0.05%三氟乙酸的浓度梯度为0%～40%的乙腈溶液作为洗脱液进行线性洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1mL/min，检测波长为214nm，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性，收集得到抗氧化活性最高的组分。利用Q-TOF LC-MS鉴定组分的氨基酸序列，得到如权利要求1所述的抗氧化多肽的氨基酸序列为：Tyr-Tyr。

为了实现上述方案，本发明采取的具体步骤如下：

(1)黑鲨鱼皮蛋白的酶解