[发明专利]鉴别或辅助鉴别甘草的引物对及其应用有效

专利信息
申请号: 201810747468.5 申请日: 2018-07-09
公开(公告)号: CN109735644B 公开(公告)日: 2022-04-08
发明(设计)人: 王继永;郑司浩;尚兴朴;邓庭伟;刘美娟;李进瞳;曾燕 申请(专利权)人: 中国中药有限公司;国药种业有限公司
主分类号: C12Q1/6895 分类号: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
代理公司: 北京知联天下知识产权代理事务所(普通合伙) 11594 代理人: 王冲;吴鑫
地址: 102600 北京市*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 鉴别 辅助 甘草 引物 及其 应用
【说明书】:

发明涉及鉴别或辅助鉴别甘草的引物对及其应用,该引物对可用于对待测甘草是否是新疆产甘草进行鉴别。

技术领域

本发明涉及鉴别或辅助鉴别甘草的引物对及其应用,该引物对可用于对待测甘草是否是新疆产甘草进行鉴别。

背景技术

甘草为豆科甘草属药材,《中国药典》规定甘草药材植物来源为甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根和根茎。市场上甘草药材以甘草(又称乌拉尔甘草)来源为主,其产地多分布于新疆、甘肃、宁夏、内蒙古等省份。

目前在甘草种子市场上,不同产地甘草的种子价格差异显著,新疆产甘草的种子价格普遍比其他产地(包括内蒙、甘肃、吉林等省份)低近一半左右。这就导致在市场交易及流通过程中,新疆产甘草的种子经常混杂在其他产地的种子中进行销售。而从甘草种子的外观形态方面很难准确区分新疆产甘草。

分子标记技术如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA,随机扩增多态性DNA标记)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism,扩增片段长度多态性)、SSR(Simple Sequence Repeat,简单重复序列标记)等结果可重复性差、工作量大、成本高。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指发生在染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。在漫长的进化过程中,生物体形成了自身特有的DNA碱基序列,比较不同物种间或同一物种不同地方品种间的SNP差异,可以了解物种间的亲缘关系和进化的生物信息学,从而对不同物种或同一物种不同地方的品种进行精细鉴定和分类。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测,单个核苷酸多态性标记可帮助区分个体间遗传物质的差异。

发明内容

本发明涉及一种基于单核苷酸多态性标记的鉴别或辅助鉴别新疆产甘草的方法,运用分子生物学的分子标记技术,对不同产地的甘草植物样本进行DNA提取,PCR扩增,引物筛选及生物信息学分析,找到快速准确鉴别新疆产甘草的方法。

发明人通过大量阅读文献以及实地调研等方式确定甘草的主产区。甘草目前主要分布在新疆、甘肃、宁夏、陕西、内蒙古等地,野生与栽培均有资源分布。通过深入甘草主产区,与当地种植大户沟通,采集了大量正品的甘草野生与栽培样本。

通过对采集的样本进行DNA提取,运用不同的序列引物进行PCR扩增,并测序,通过生物信息学分析比对序列,筛选的序列包括核基因序列ITS(Internal transcribedspacer,内转录间隔区)与ITS2(Internal transcribed spacer 2),叶绿体基因序列psbA-trnH(主要是指psbA与tRNA-His intergenic spacer region间隔区序列)、rbcL(ribulose1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)、matK(maturase K)。

运用MEGA软件进行序列比对与分析,找到可以稳定准确鉴别新疆产甘草的引物序列(在该序列某一位点或某几个位点,新疆产甘草与其它产地样本的碱基均不一样,且各自一致)。通过最终数据比对筛选,发现叶绿体基因组psbA-trnH序列可以将新疆产甘草与其它产地甘草进行鉴别。经过序列比对分析,发现在psbA-trnH序列中的270位点(psbA-trnH序列为独立的序列,有其固定的组成部分,为psbA、psbA-trnH intergenic region、trnH,虽然不同物种之间各组成部分的长度不同,但同一物种或其近缘种的psbA-trnH序列的长度是基本一致的。而且通过MEGA软件进行序列比对后,每条序列的碱基均相对应,保证每条序列都是在270位点处产生碱基突变),呈现规律性的突变碱基(Single NucleotidePolymorphisms,单核苷酸多态性,SNP变异位点)。新疆产甘草在psbA-trnH序列的270位点为T碱基,其它产地的甘草在psbA-trnH序列的270位点为C碱基(如图1所示)。

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