[发明专利]一种检测马铃薯卷叶病毒的荧光定量PCR方法在审
| 申请号： | 201810903536.2 | 申请日： | 2018-08-09 |
| 公开（公告）号： | CN109097492A | 公开（公告）日： | 2018-12-28 |
| 发明（设计）人： | 陈兆贵;叶新友;侯红因;邢澍祺;毛露甜;黄雁 | 申请（专利权）人： | 惠州学院 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/94 |
| 代理公司： | 惠州市超越知识产权代理事务所(普通合伙) 44349 | 代理人： | 陈文福;郝丽娜 |
| 地址： | 516000 *** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 马铃薯 荧光定量PCR 反转录 卷叶 种检测 病毒 总RNA 检测 实时荧光定量PCR 生物检测技术 马铃薯植株 定量分析 病毒基因 材料消耗 定量检测 分子水平 两对引物 内参基因 特异性强 引物设计 灵敏度 扩增 引物 基因 | ||
1.一种检测马铃薯卷叶病毒的荧光定量PCR方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）RNA提取：提取马铃薯的总RNA；
（2）反转录：将提取的总RNA反转录成cDNA；
（3）引物设计：分别设计用于扩增内参基因和PLRV基因的两对引物；
（4）荧光定量PCR：将反转录的cDNA和设计好的引物配制成PCR反应体系，进行实时荧光定量PCR反应。
2.根据权利要求1所述的一种检测马铃薯卷叶病毒的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述步骤（1）与所述步骤（2）之间还包括步骤（1.1）总RNA的纯度检测：使用超微量分光光度计检测总RNA浓度和纯度，检验提取的RNA质量是否合格。
3.根据权利要求2所述的一种检测马铃薯卷叶病毒的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述步骤（1.1）与所述步骤（2）之间还包括步骤（1.2）总RNA的完整性检测：采用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用凝胶成像分析系统进行观察，并记录成像。
4.根据权利要求1所述的一种检测马铃薯卷叶病毒的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述步骤（3）中，引物包括用于扩增内参基因的引物Actin-F和引物Actin-R、以及用于扩增PLRV基因的引物PLRV2-F和引物PLRV2-R，4条引物的核苷酸序列分别为：
Actin-F：5’-GCTTCCCGATGGTCAAGTCA-3’
Actin-R：5’-GGATTCCAGCTGCTTCCATTC-3’
PLRV2-F：5’-CGCCGAAGACGCAGAAGAGGA-3’
PLRV2-R：5’-AGACTCGGCCCGAAGGTGAA-3’。
5.根据权利要求1所述的一种检测马铃薯卷叶病毒的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述步骤（4）中， PCR反应体系以20μL计包括：2×TB Green Premix Ex Taq II 10μL、10 μM PCR Forward Primer 0.8μL、10 μM PCR Reverse Primer 0.8μL、50×ROX ReferenceDye 0.4μL、cDNA模板2μL和灭菌水6μL。
6.根据权利要求1所述的一种检测马铃薯卷叶病毒的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述步骤（4）中，PCR扩增的反应条件为：第一阶段：50℃预热保温2min，95℃预变性10min；第二阶段：95℃变性15s，60℃退火延伸1min；第三阶段：95℃变性15min，60℃退火延伸1min，随后以0.05℃/s的升温速度升温到95℃。
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