[发明专利]一种检测马铃薯卷叶病毒的荧光定量PCR方法

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测马铃薯卷叶病毒的荧光定量PCR方法，包括如下步骤：（1）RNA提取：提取马铃薯的总RNA；（2）反转录：将提取的总RNA反转录成cDNA；（3）引物设计：分别设计用于扩增内参基因和PLRV基因的两对引物；（4）荧光定量PCR：将反转录的cDNA和设计好的引物配制成PCR反应体系，进行实时荧光定量PCR反应。本发明的检测方法能在分子水平上检测出马铃薯植株中存在的马铃薯卷叶病毒，并能对病毒基因的表达情况进行定量分析，具有高效、特异性强，准确性和重复性好，灵敏度高，检测速度快，材料消耗少，成本低以及能够定量检测等优点。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测马铃薯卷叶病毒的荧光定量PCR方法。

背景技术

马铃薯卷叶病毒（PLRV）被归类为黄化病毒组（Luteovirus），是马铃薯卷叶病毒属的一员，是马铃薯病毒病中危害马铃薯生产的最主要病毒之一。PLRV病毒粒体呈球状，等轴对称，直径24nm，是一种正链RNA病毒，无3＇端poly A, 5＇端严格保守的序列5～20bp。该病毒以种薯传播，在田间以持久方式由蚜虫进行传播，不能通过机械传播，寄主植物的维管束是其主要的分布部位。病毒在寄主体内含量低，难以大量提纯，致使人们不能很好的对PLRV进行彻底的分子生物学研究。 鉴定PLRV传统的方法包括了目测法、生物学实验法（也称为“指示植物法”）以及电镜技术法等。随后出现了酶联免疫检测法和核酸分子检测技术。与实时荧光定量PCR技术相比，其他方法都存在一些不足之处，如耗时比较长、检测材料消耗量大、灵敏度低以及不能够对病毒进行定量检测等。实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高，不仅可以对样本进行实时快速的检测，而且能够进行定量分析。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种检测马铃薯卷叶病毒的荧光定量PCR方法，该方法能在分子水平上检测出马铃薯植株中存在的马铃薯卷叶病毒，并能对病毒基因的表达情况进行定量分析，具有高效、特异性强，准确性和重复性好，灵敏度高，检测速度快，材料消耗少，成本低以及能够定量检测等优点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测马铃薯卷叶病毒的荧光定量PCR方法，包括如下步骤：

（1）RNA提取：提取马铃薯的总RNA；

（2）反转录：将提取的总RNA反转录成cDNA；

（3）引物设计：分别设计用于扩增内参基因和PLRV基因的两对引物；

（4）荧光定量PCR：将反转录的cDNA和设计好的引物配制成PCR反应体系，进行实时荧光定量PCR反应。

优选的，所述步骤（1）与所述步骤（2）之间还包括步骤（1.1）总RNA的纯度检测：使用超微量分光光度计检测总RNA浓度和纯度，检验提取的RNA质量是否合格。

优选的，所述步骤（1.1）与所述步骤（2）之间还包括步骤（1.2）总RNA的完整性检测：采用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用凝胶成像分析系统进行观察，并记录成像。

优选的，所述步骤（3）中，引物包括用于扩增内参基因的引物Actin-F和引物Actin-R、以及用于扩增PLRV基因的引物PLRV2-F和引物PLRV2-R，4条引物的核苷酸序列分别为：

Actin-F：5’-GCTTCCCGATGGTCAAGTCA-3’

Actin-R：5’-GGATTCCAGCTGCTTCCATTC-3’

PLRV2-F：5’-CGCCGAAGACGCAGAAGAGGA-3’

PLRV2-R：5’-AGACTCGGCCCGAAGGTGAA-3’。