[发明专利]塞内卡病毒和口蹄疫病毒双重实时荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种鉴别塞内卡病毒(SVA)和口蹄疫病毒(FMDV)的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针。本发明的试剂盒中含有两对引物和两条探针，引物和探针分别针对塞内卡病毒(SVA)和口蹄疫病毒(FMDV)保守基因区设计。本发明的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好，可以实现对塞内卡病毒和口蹄疫病毒准确定量，将在塞内卡病毒和口蹄疫病毒的检测及疫苗生产、例如疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗中发挥重要作用，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域中的兽医动物病原检测，特别涉及一种用于对塞内卡病毒和口蹄疫病毒进行定性、定量检测的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针。

背景技术

塞内卡病毒(Seneca Virus A，SVA)和口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth DiseaseVirus，FMDV)同属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，都是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，塞内卡病毒属于Seneca Virus病毒属的典型代表，与心病毒属(Cardio Virus)最接近，而口蹄疫病毒属于口蹄疫病毒属病毒。

塞内卡病毒是主要发生于猪的一种传染病，其临诊特征为感染猪只鼻部和口腔形成溃疡、厌食、跛行，导致新生仔猪急性死亡。早期塞内卡病例主要发生于育肥猪，鼻部、口部和蹄部的冠状带部可见水疱症状，但最近发现的一些塞内卡阳性病例发生于新生仔猪，症状为腹泻，无水疱病变，这些病例主要是通过对血清、粪便和不同组织进行PCR检测发现的。2002年在美国马里兰州的一家公司首次发现，2007年，一批从加拿大运往美国明尼苏达州的猪鼻镜出现水泡、蹄部冠状带溃烂等类似水疱病症状，经检测排除口蹄疫、水泡性口炎病和猪水疱病，最终通过PCR检测确定为塞内卡病毒阳性。之后2014年至今在美国、中国、加拿大、巴西、泰国、哥伦比亚等多国均发现SVA病毒导致的临床病例，并进一步确定是由SVA导致致病。在2007年之前，SVA主要作为溶瘤细胞被研究，可有效治疗一些神经内分泌肿瘤。

口蹄疫病毒可引起牛、猪和羊等偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病，以口腔黏膜、舌面、唇、鼻镜、蹄部和乳房皮肤发生水疱和溃烂为特征。口蹄疫平均致死率仅为1％，但是被感染动物100％发病，且传播效力极高，使实际的畜产量锐减。FMD一旦爆发将造成巨大的经济损失，因此世界各国对该病的研究极为重视。鉴于其危害之大，影响范围之广，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类烈性传染病之首。

近几年，由于塞内卡病毒的发现，仅从临床症状上无法区分SVA感染和FMDV感染，给临床确诊带来了难度，需要用实验室检测技术加以确定。如何用快速、简单的方法检测、区分塞内卡病毒和口蹄疫病毒是一些猪场急需解决的问题。

另一方面，疫苗是预防病毒的最有效措施，其中灭活疫苗在传染病的预防中发挥着重要作用，制备灭活疫苗是预防塞内卡病毒以及口蹄疫病毒流行的主要有效手段。在疫苗制备中，对病原进行有效的灭活，可提供安全的疫苗，主要通过将塞内卡病毒、口蹄疫病毒体外培养后灭活，然后与乳化剂混合制成免疫疫苗。在制备多价疫苗例如塞内卡病毒和口蹄疫病毒双价疫苗时，准确、特异、快速地检测塞内卡病毒以及口蹄疫病毒抗原的水平在疫苗生产监控等方面具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供用于对塞内卡病毒(SVA)和口蹄疫病毒(FMDV)进行双重实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，并实现塞内卡病毒(SVA)和口蹄疫病毒(FMDV)的定性、定量检测。

本发明所提供的用于对塞内卡病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物为：上游引物(SVA-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，下游引物(SVA-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

由上述引物衍生的引物序列也属于本发明内容。所述衍生序列是指在SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。