[发明专利]一种能够排除抗体信号干扰的免疫共沉淀方法

说明书

本发明提供了一种能够排除抗体信号干扰的免疫共沉淀方法。所述免疫共沉淀方法使用交联剂DSS将抗体和Protein‑A/G琼脂糖珠交联，然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白‑抗体‑Protein‑A/G琼脂糖珠复合物，最后离心去除抗体‑Protein‑A/G琼脂糖珠复合物，上清中只留下目的蛋白，从而在蛋白质印迹实验中避免抗体重链和轻链分子信号对目的蛋白检测的干扰。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能够排除抗体信号干扰的免疫共沉淀方法。

背景技术

免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“Protein A/G特异性地结合到抗体(免疫球蛋白，Ig)的可结晶片段(Fragment crytallizable,Fc)的现象开发出来的方法。免疫沉淀实验用途非常广泛，其中之一便是免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)。免疫共沉淀是基于抗体和抗原之间结合的专一性用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定蛋白质是否在生理条件下有相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质也能沉淀下来，然后再利用蛋白质印迹(Western Blotting，WB)或者质谱来确认相互作用的蛋白。

这种方法常用于测定目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用蛋白。免疫共沉淀实验对于蛋白质互作研究有许多优势。例如：(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物(AndersonN.G.Co-Immunoprecipitation.In:Clegg R.A.(eds)Protein TargetingProtocols.Methods in Molecular Biology.1998,vol 88.Humana Press)。

时至今日，Co-IP已经发展成为生命科学研究中应用最广泛的方法之一。J Zhong等人利用Co-IP技术确认了Mcl1a蛋白和Noxa蛋白在斑马鱼胚胎早期发育时的相互作用，并且这种蛋白互作调控胚胎早期发育(Zhong JX,Zhou L,et.al.Zebrafish Noxa promotesmitosis in early embryonic development and regulates apoptosis in subsequentembryogenesis[J].Cell Death&Differentiation,2014,21(6):1013-24.)。耐力训练会使人体肌肉发生脂肪酸氧化，并释放出大量能量供机体利用，S Schenk等人通过Co-IP证明FAT/CD36蛋白和CPT I转移酶之间的结合可以增强这个生理过程(Schenk S,HorowitzJF.Coimmunoprecipitation of FAT/CD36and CPT I in skeletal muscle increasesproportionally with fat oxidation after endurance exercise training[J].Am JPhysiol Endocrinol Metab,2006,291(2):E254-60.)。HIV是一种逆转录病毒，SergeyN.Iordanskiy等人运用Co-IP技术发现了宿主细胞内与HIV逆转录复合体结合的蛋白，揭示了HIV病毒如何在细胞内成熟和入核的机制(Sergey N.Iordanskiy and MichaelI.Bukrinsky.Analysis of viral and cellular proteins in HIV-1reversetranscription complexes by co-immunoprecipitation[J].Methods Mol Biol,2009；485:121 134.)。