[发明专利]一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法及其应用

权利要求书

1.一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法，其特征在于，在干细胞肝向分化过程中转染miR-142-3p抑制剂，所述miR-142-3p抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)干细胞的分化：在Matrigel-分化培养板中加入已培养好的人类干细胞悬液，加入不同的分化培养基培养分化干细胞；

2)转染miR-142-3p抑制剂：于干细胞分化的第8天，配置含有miR-142-3p抑制剂的转染液体并弃去分化培养基，并滴入转染液体，于培养箱中转染；

3)转染后干细胞的分化：转染后弃去所有液体，加入含有不同的分化培养基培养分化干细胞；

4)步骤3)培养第18天时，收取细胞，做肝样细胞的分子和功能检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中Matrigel的终使用浓度为1.6％。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述干细胞为人胚胎干细胞或多功能干细胞，所述干细胞需达到80％覆盖率后方可用于制备人类干细胞悬液。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述分化培养基由低糖DMEM、MCDB-201培养基、0.25x的LA-BSA、0.25x的ITS、P/S双抗、抗坏血酸溶液、地塞米松溶液和β-巯基乙醇组成，体积比为285:200:1.25:1.25:5:5:2:0.5。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述培养的方式为：

第0天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有100ng/ml Activin-A的Activin-A分化培养基，培养2天；

第2天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有50ng/ml Wnt3a的Wnt3a分化培养基，培养2天；

第4天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有50ng/ml BMP4的BMP4分化培养基，培养2天；

第6天，弃去2/3的培养基，加入含有50ng/ml BMP4的BMP4分化培养基，培养2天。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)在干细胞肝向分化的第8天转染10nM的miR-142-3p抑制剂。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述培养的方式为：

第8天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有20ng/ml FGF1的FGF1分化培养基，培养2天；

第10天，弃去2/3的培养基，加入含有20ng/ml FGF1的FGF1分化培养基，培养2天。

第12天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有20ng/ml HGF和10ng/ml OSM的HGF-OSM分化培养基，培养2天；

第14天，弃去2/3的培养基，PBS清洗，加入含有20ng/ml HGF和10ng/ml OSM的HGF-OSM分化培养基，培养2天；

第16天与第14天的培养方式相同。

9.miR-142-3p抑制剂在生产人源性肝细胞及利用所述人源功能性肝细胞进行药物研发方面的应用，其特征在于，所述miR-142-3p抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

10.权利要求1-8任意一项所述的方法在生产人源性肝细胞及利用所述人源功能性肝细胞进行药物研发方面的应用。