[发明专利]一种提取质粒DNA的菌体裂解液、试剂盒及提取质粒DNA的方法

说明书

本发明涉及一种提取质粒DNA的菌体裂解液、试剂盒及提取质粒DNA的方法，属于生物技术领域。本发明提取质粒DNA的菌体裂解液由裂解缓冲液、溶菌酶、RNase A组成，裂解缓冲液的组成为：每100mL裂解缓冲液中含有1.5～10g蔗糖、0.7～2.2g乙二胺四乙酸二钠、0.3～0.9g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、2.7～5.4g NH₄Cl、0.1～2.0mL 0.5％的Triton X‑100、0.2～0.6g CaCl₂、0.5～8g盐酸胍、0.5～3g异硫氰酸胍，其余量为水。本发明提取质粒DNA的试剂盒，包括上述菌体裂解液、漂洗液和洗脱液。该试剂盒成本低、提取质粒纯度高、适用性好。

技术领域

本发明涉及一种提取质粒DNA的菌体裂解液、试剂盒及提取质粒DNA的方法，属于生物技术领域。

背景技术

质粒DNA是现在分子生物学实验中常用的基因运载工具，在基因工程领域应用广泛。质粒DNA的分离提取是分子生物学实验中的一种常规技术，其提取效率、纯度和质量直接影响着后期分子生物学试验，如酶切、连接、大肠埃希菌的转化、转染哺乳动物细胞、PCR扩增和测序等过程的成败。

从原核生物中提取质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。较常用的菌体裂解方法有三种：煮沸法、去污剂(如TritonX-100和十二烷基磺酸钠)裂解法和碱裂解法。煮沸法操作简单、时间短，但是条件过于剧烈，易造成质粒断裂，回收率较低。去污剂裂解法比较温和，一般用于分离高拷贝质粒。目前质粒DNA最广泛的提取方法是采用强碱裂解法，需要用到三种溶液，溶液1的主要作用是将菌体沉淀悬浮起来；溶液2的主要作用是细胞裂解，溶液2包括两种成分：氢氧化钠和十二烷基磺酸钠(SDS)，氢氧化钠破坏细胞膜的结构，同时使染色体DNA氢键断裂，但是质粒DNA是超螺旋共价闭合的环状互补链相互盘绕，不会完全分离，SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀；溶液3的主要作用是中和第二步加入的强碱以及清除掉蛋白质等细胞内的杂质，主要包括醋酸钾和醋酸。溶液2中平均一个SDS分子就会结合两个氨基酸形成多肽复合体，同时变性的蛋白质与基因组DNA缠绕。当加入醋酸钾后，钾离子置换SDS中的钠离子生产十二烷基磺酸钾，十二烷基磺酸钾不易溶于水，从而将变性的蛋白质和绝大部分基因组DNA沉淀。其中醋酸的加入可以中和氢氧化钠，缓冲液恢复至中性，质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而染色体DNA较难复性形成缠绕的网状结构，与蛋白质-SDS复合物等通过离心沉淀。碱裂解法操作简单、质粒提取纯度高、质粒获得量较多且污染较少，但是该方法花费的时间较长。

德国Eppendorf公司发明了一步法提取质粒的方法，该方法简化了繁琐的提取步骤，但是只适用于高拷贝质粒的提取，不适合于大肠杆菌质粒的提取，而大肠杆菌是目前最常用的生产菌株，因此该方法具有一定的局限性。现有技术中也存在一步提取质粒DNA方法的报道，申请公布号为CN107254466A的中国发明专利申请公开了一种一步法提取质粒DNA的试剂盒和方法，该提取质粒DNA的试剂盒包括裂解试剂、漂洗液和洗脱缓冲液，其裂解试剂包括溶菌酶、RNaseA和裂解缓冲液，裂解缓冲液的组成为：每100mL中包括月桂酰基丙基甜菜碱5～10g、氯化钙1～2.5g、二甲基亚砜1～5g、甘油1～2.5g、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐1～2.5g、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐1～2.5g、三(羟甲基)氨基甲烷1～2.5g、盐酸胍1～3.5g、异硫氰酸胍1～2.5g、尿素5～10g、乙二胺四乙酸二钠1～2.5g，其余为水。该试剂盒及方法虽然适用于大肠杆菌，但是其裂解液配方复杂，成本高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种提取质粒DNA的菌体裂解液，该菌体裂解液中组分简单，裂解效果好，经济节约。

本发明还提供一种提取质粒DNA的试剂盒，该试剂盒的组分简单，成本低。

本发明还提供一种利用上述提取质粒DNA的试剂盒提取质粒DNA的方法。该方法提取质粒DNA操作简便，提取效率高。