[发明专利]核酸合成方法

说明书

本发明涉及核酸合成领域。具体地，本发明涉及使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，所述浸泡式反应方案包括使其上固定有起始核酸分子的固体支持物依次浸泡在含有反应试剂、终止试剂、切除试剂、洗涤试剂的不同的反应容器中以实现核酸合成。

技术领域

本发明涉及核酸合成领域。具体地，本发明涉及使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，所述浸泡式反应方案包括使其上固定有起始核酸分子的固体支持物依次浸泡在不同的反应容器中以实现核酸合成。

背景技术

随着基因组研究的深入，从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。近来，核酸合成技术越来越受到人们的重视。目前，基本上所有的人工合成DNA都是使用30多年前开创的核苷亚磷酰胺方法生产。经过数十年的液体处理的微调和改进之后，实践中亚磷酰胺基寡核苷酸合成的上限现在约为200-300nt。在此基础上，各大商业公司开发了各自不同的技术，并推出了一些商业化的机器。这些合成仪大体可以分为两种：柱式合成仪和微阵列合成仪。柱式合成仪以Dr.oligo 192和mermade为代表,通过电磁阀控制试剂的添加，在尺寸为厘米级别的多孔反应柱上进行固相合成反应。该方法错误率较低，但是合成通量不高而且所需物料也较多。微阵列合成仪以CustomArray合成仪为代表，是将合成反应缩小到微米级别的反应孔内，一张芯片上有上万个反应孔，这样虽然提高了合成通量也一定程度上减少了原料的消耗，然而产量低，电化学反应不易控制，且错误率较高。另外，从进样方式上看，柱式和微阵列核酸合成仪均为将合成试剂通过预先铺设的管线加到合成柱或者合成芯片上，且加入的试剂大大过量，这就造成了试剂的极大浪费和低物料使用率。

近期，科学家们描述了使用模板非依赖性聚合酶末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的寡核苷酸合成策略(见WO2017223517A1)，其方法为：每个TdT分子与单个可掺入起始核酸分子的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)分子偶联形成TdT-dNTP conjugates，TdT分子与dNTP通过一个可切割的基团连接。在延伸过程中，起始核酸分子的3'末端保持与TdT-dNTP共价结合并且不能与其他TdT-dNTP分子接触。在去保护过程中，用切除试剂切割TdT和掺入的核苷酸之间的连接子，从而释放合成的核酸分子并允许继续进行随后的延伸。

在现有的固相核酸合成方法中，是将合成试剂通过预设的合成柱、合成芯片或者合成磁珠上，需要加入过量的试剂，反应不完全，会造成试剂的极大浪费。因此，本领域迫切需要新的高通量的、低成本的核酸合成方法。

发明内容

针对现有核酸合成方法存在的问题，本发明提供了使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，所述浸泡式反应方案包括使其上固定有起始核酸分子的固体支持物依次浸泡在含有不同试剂的反应容器中以实现核酸合成。本发明通过生化试剂重复利用、大幅度提高了通量，从而降低了核酸合成的成本。

如本文所用的术语“浸泡式反应方案”意指在核酸合成的过程中，固定有起始核酸分子的固体支持物移动至与反应试剂接触，而非使用流动通道使反应试剂移动至与固定在固相载体上的核酸接触。所述浸泡式反应方案至少具有以下优势：1.生化试剂重复利用；2.扩展性好，使用灵活，能够大幅提高通量；3.不需要复杂的温度和流体控制系统，反应较均匀；4.显著降低核酸合成成本。

在本文所述的方法中，核酸合成可以利用多种固体支持物(即固相载体)实现，其实例包括但不限于芯片、磁珠、柱。在一些实施方案中，核酸合成的过程可以是自动化过程。应当理解，任何已知的固相核酸合成过程都可以结合到本文所述的浸泡式反应方案中。

在一个实施方案中，本发明提供了使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，包括以下步骤：

a.提供其上固定有起始核酸分子的固体支持物，

b.将所述固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dNTP的第一反应容器中，使所述起始核酸分子与TdT-dNTP充分反应，生成第一延伸产物；