[发明专利]一种罗汉果苷的制备方法

说明书

罗汉果苷IIIE甜度高、口味较好，但在罗汉果中含量极低，无法大量提取制备。本发明公开发明了一种采用糖基水解酶定点水解罗汉果苷V生物合成罗汉果苷IIIE的方法，可用于罗汉果苷IIIE的大量绿色化制备，亦可为罗汉果苷IIIE的结构改造提供了物质基础。

技术领域

本发明属于天然产物生物合成和食品化工技术领域，具体涉及利用异源表达的糖苷水解酶水解罗汉果苷V制备天然非糖类甜味剂罗汉果苷ⅢE。

背景技术

近些年来，由于高能量饮食的过多摄入，糖尿病、肥胖症等患者逐年增多，且由此产生的并发症对人类健康产生了严重危害。因此，寻找并开发低热量、健康的新型非营养型甜味剂逐渐成为行业的需求。由于口味纯正、甜度高、绿色健康等特点，罗汉果苷已逐渐成为新型天然非营养型甜味剂开发的一类热点化合物。自1983年Takemoto等从罗汉果S.grosvenorii果实中分离出甜味化合物罗汉果苷(Mogroside,MG)IV、V和VI后，已有超过30种同系列化合物被陆续分离鉴定，它们均为罗汉果苷元([10α-cucurbit-5-ene-3β,11α,24(R),25-tetraol])连接2至6个葡萄糖单元的四环三萜皂苷(Li C,etal.Chin.J.Nat.Med.,2014,12:89-102)。罗汉果苷初步甜味构效关系研究发现，含3个葡萄糖单元是罗汉果苷具有甜味的结构基础(Wang L,et al.Molecules,2014,19:12676-12689.)，例如，罗汉果苷IIIE、IV、V和赛门苷I的甜度分别是5％蔗糖的300倍、350倍、425倍和560倍，但口味有所差异。因此，采用糖基化酶对具有3个葡萄糖基的罗汉果苷如罗汉果苷IIIE进行定点糖基化修饰，可获得一系列口味独特的非营养型甜味剂。

罗汉果苷仅占罗汉果干燥果实的3.82％，结构中含3个糖的罗汉果苷IIIE含量甚微(LI C,et al.J.Natural Medicines.,2014,12:89-102)，已成为了基于罗汉果苷IIIE的糖基化修饰开发不同口味的新型罗汉果苷类甜味剂的瓶颈。由于化学合成方法难度极大且成本高，市场接受度低，所以立体选择性和部位选择性强且绿色环保的生物催化剂成为罗汉果苷IIIE制备的首选策略。鉴于罗汉果苷V是罗汉果提取物中含量最高的甜味化合物，也是目前唯一可产业化提取制备的罗汉果苷类化合物。在结构分析后发现，罗汉果苷V只需选择性水解3位和24位以β-1,6-糖苷键连接的葡萄糖单元即可获得罗汉果苷IIIE。因此采用专一性强的糖苷水解酶建立绿色化罗汉果苷IIIE酶法合成工艺成为最佳选择。

基于上述分析，本发明采用来源自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的糖苷水解酶EXG1及其突变体EXG19对罗汉果苷V进行选择性水解，以绿色化制备罗汉果苷IIIE。与现有的天然提取方法相比，本发明提供了一种解决了罗汉果苷IIIE大量获得的方法，使基于IIIE糖基化修饰获得不同口味的罗汉果苷类甜味剂提供了物质基础。

发明内容

本发明的目的在于采用专一性强的糖苷水解酶EXG1及其突变体EXG19水解罗汉果苷V建立一种绿色、高效、经济的罗汉果苷ⅢE生物合成新方法。为基于罗汉果苷ⅢE的糖基化修饰开发新型优质非营养型甜味剂、药品和药用辅料奠定基础。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案具体如下：

1)糖苷水解酶的基因来源

糖苷水解酶EXG1来源自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，基因序列如SEQ IDNO:1所示；糖苷水解酶EXG19为EXG1的突变体，基因序列如SEQ ID NO:2所示。

2)糖苷水解酶异源表达工程菌构建