[发明专利]一种遗传性消化道肿瘤的基因文库构建方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种遗传性消化道肿瘤的基因文库构建方法，涉及APC，CDH1，MSH2，MLH1，MSH6，PMS2，EPCAM共7个基因的突变。目标区域为以上7基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域。为保证目标区域全部覆盖，PCR扩增过程中所必须的引物组被分离为两个独立引物组，分别进行目标区域扩增。而后将PCR产物进行测序标签连接、文库洗脱及再扩增，扩增后纯化，得到测序用文库。该建库方法步骤简单快速，有效降低了文库构建的成本，且涵盖了消化道肿瘤的相关基因。结合高通量测序仪，可快速准确得到相关基因变异，对遗传性消化道肿瘤有重要意义。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种遗传性消化道肿瘤的基因文库构建方法和试剂盒。

背景技术

消化道肿瘤是世界范围内高发的恶性肿瘤。在恶性肿瘤中，胃癌、结直肠癌大多数为散发性，但约10％的胃癌患者具有家族聚集特诊，约5～10％的肠癌穿着具有遗传相关因素。遗传性弥漫性胃癌和遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)是具有相对明确遗传因素的两种遗传性消化道肿瘤。

在遗传性弥漫性胃癌家系中，小叶性乳腺癌和结肠癌等肿瘤的发生率也明显升高。部分无明确家族史的早发(年龄＜50岁)弥漫性胃癌存在CDH1基因突变。对于遗传性家系中CDH1基因突变携带者，其终身患胃癌风险高达60～80％。在符合遗传性弥漫性胃癌的家系中，约有40％～50％存在CDH1基因胚系突变。

根据胃肠道内是否出现多发息肉，遗传性结直肠癌可初略分为两大主要类型：(1)遗传性息肉病性结直肠癌综合征：以结直肠广泛分布腺瘤为主要特征，临床常见家族性腺瘤性息肉病FAP其腺瘤数量超过100枚；(2)遗传性非典型息肉病性结直肠癌综合征：结直肠内存在少量或没有明显息肉性病变，其临床特征表现为早发结直肠癌伴随多种肠内外肿瘤病变。Lynch综合征为该类病症的临床典型代表。

Lynch综合征为常染色体显性遗传性疾病，已经明确的致病基因包括错配修复基因家族成员(Mismatch Repair Gene，MMR)的胚系突变，如MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等，以及与之相关的部分基因如EPCAM。其中MLH1和MSH2基因胚系突变为最常见的致病机理，占所有Lynch综合征基因变异的90％。我国各临床科研机构检测及报道的致病基因也主要为MLH1、MSH2和MSH6。

家族性腺瘤性息肉病(FAP)也是一种临床常见的遗传性结直肠癌综合征，大约1％的结直肠癌发病与之相关，其最显著的临床特征在于患者结直肠内会有成百上千的息肉形成，且在青少年时即会出现息肉。根据息肉的数量可分为经典型FAP(息肉数量>100枚)和衰减型FAP(息肉数量>20枚但<100枚)。同时可能伴随部分肠外病变如胃十二指肠息肉、先天性视网膜色素上皮肥厚、多生牙、骨瘤等，其中伴发硬纤维瘤的FAP又称Gardner综合征，伴发中枢神经系统肿瘤的FAP又称Turcot综合征⑥。FAP的临床恶性程度极高，若不治疗，几乎所有经典型FAP患者在40～50岁都会发展为结直肠癌⑦。

FAP为常染色体显性遗传性疾病，其遗传学特征为APC基因的胚系突变致病，且存在明显的基因-表型相关性：腺瘤数目越多，检测到APC基因异常的机率越高；不同的FAP患者可能在APC基因的不同位置出现异常，且与临床表型相关。

无论是遗传性胃癌还是HNPCC，约50％甚至更多的符合临床诊断的患者或家系无法找到明确的分子致病机制，原因可能为：①临床诊断符合某类遗传性病综合征，对目标基因进行检测未发现突变，但不能除外患者是否携带尚未发现的致病性基因；②临床上符合某类遗传性病综合征的诊断，但至致病基因是由于位置基因所致；③由于临床表现多样和肿瘤家族史不典型，其临床诊断的遗传综合征于遗传性致病基因不符。目前，高通量测序技术应用广泛，该项技术科同时进行上百万个DNA片段的测序，测序时间和测序成本都大大减少，针对遗传性相关基因谱的测序为遗传性消化道肿瘤的诊断和研究提供了大量信息。