[发明专利]一种检测球形孢子丝菌的实时荧光PCR引物、探针及试剂盒

说明书

本发明提供了一种检测球形孢子丝菌的实时荧光PCR引物、探针及试剂盒。通过对孢子丝菌复合体的ITS序列比对，发现具有差异碱基的序列，针对该序列设计实时荧光PCR引物和探针，其序列如SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3所示。本发明的引物和探针能够特异、灵敏、准确地检测球形孢子丝菌，对球形孢子丝菌的检测限达到10fg，优于现有技术对球形孢子丝菌的检测灵敏度，具有良好的标本检测能力。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于鉴别球形孢子丝菌的荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行球形孢子丝菌检测的方法和试剂盒。

背景技术

孢子丝菌病(Sporotrichosis)是由双相真菌申克孢子丝菌复合体(Sporothrixschenckii complex)侵犯皮肤及皮下组织引起的慢性感染性疾病。病程长，皮损可固定于局部，或延淋巴管走行，严重者可通过血行系统播散，引起内脏器官的感染，也有报道称吸入的孢子可直接引起肺部感染。早期人们对申克孢子丝菌认识有限，认为其为单一物种。随着基因组学以及分子检测手段的不断发展，发现申克孢子丝菌是由多个亲缘种构成的复合体，其中球形孢子丝菌、申克孢子丝菌和巴西孢子丝菌构成了孢子丝菌属中主要的临床致病菌，其余孢子丝菌多为环境菌株，基本不致病。其中，球形孢子丝菌作为主要的临床致病菌，主要分布在亚洲地区，尤其是我国东北地区。许多研究学者对国内不同地区分离获得的孢子丝菌进行分子生物学鉴定，发现我国分布的基本全是球形孢子丝菌，仅在江西地区出现过一次发现申克孢子丝菌的报道。随着对孢子丝菌复合体研究的深入，发现不同种之间在致病力及药物敏感性方面存在明显差异，因此在孢子丝菌病的诊断及治疗过程中，对病原菌鉴定到种是十分必要的。

目前，临床上常用的孢子丝菌诊断方法包括直接镜检、培养、组织病理检查等。除培养外，都不能对其鉴定到种水平。由于种内形态十分相似，常需要经验丰富的真菌学专家进行鉴定，由于局部皮损真菌含量少，直接镜检阳性率较低。组织真菌培养是检测的金标准，但耗时较长，至少需要2-4周时间，因此无法作为临床快速诊断的依据。随着分子生物学技术发展，核酸检测技术逐渐应用到孢子丝菌的分型和检测中，常用的分子鉴定手段主要包括对目的片段扩增及测序、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)以及特异性引物普通PCR检测等。目前常用的孢子丝菌检测及分型的靶基因主要有内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)、钙调蛋白(calmodulin,CAL)、延长因子(elongation factors,EF)等，通过设计针对靶基因的特异性引物，扩增获得长度不同的目的片段，进一步运用琼脂糖凝胶电泳对其进行区分，从而对孢子丝菌进行种内鉴定。2015年，Rodrigues(参考文献：Rodrigues,A.M.et al.2015,9(12),e0004190.)建立了普通单重PCR检测技术可检测并区分球形孢子丝菌、申克孢子丝菌以及巴西孢子丝菌，是目前最灵敏和特异的致病孢子丝菌核酸检测技术。该方法使用普通PCR技术，检测的灵敏度和特异性相对较低，对每种致病孢子丝菌均需单独扩增，并进行凝胶电泳对扩增产物进行鉴定和检测，总检测时间至少需要三个小时以上。因此，建立更加灵敏、特异、便捷的区分不同种致病性孢子丝菌的检测技术非常必要。