[发明专利]一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法有效
| 申请号： | 201811548607.8 | 申请日： | 2018-12-18 |
| 公开（公告）号： | CN109554311B | 公开（公告）日： | 2022-01-14 |
| 发明（设计）人： | 敬文宪;刘永生;李学瑞;周建华;马丽娜 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N1/20 | 分类号： | C12N1/20;C12N1/21;C12R1/42 |
| 代理公司： | 北京兴智翔达知识产权代理有限公司 11768 | 代理人： | 郭卫芹 |
| 地址： | 730046 甘肃*** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 伤寒 沙门氏菌 外膜囊泡 提取 方法 | ||
1.一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法，其特征在于：包括下述步骤：
（1）将鼠伤寒沙门氏菌菌液，进行10,000×g，4℃，15min离心；所述鼠伤寒沙门氏菌为敲除fliC基因的鼠伤寒沙门氏菌CVCC541；
（2）回收上清，不要将菌液沉淀倒出，进行13,000×g，4℃，15min离心；
（3）回收上清，用0.45μm PVDF膜滤器进行过滤2次；
（4）将过滤的上清进行40,000×g，4℃，2h；弃去上清；将弃去上清的沉淀物用0.01M的PBS进行重悬，再用0.45μm PVDF滤器过滤，取滤液，进行40,000×g，4℃，2h的离心，弃去上清，用PBS进行重悬。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述敲除fliC基因是通过Red同源基因重组技术敲除的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述敲除fliC基因的方法如下：
（1）设计引物：
FliC-H1P1：GCAACAGCCCAATAACATCAAGTTGTAATTGATAAGGAAAAGATCgtgtaggctggagctgcttc；
FliC-H2P2：CGCTGCCTTGATTGTGTACCACGTGTCGGTGAATCAATCGCCGGAcatatgaatatcctccttag；
（2）线性打靶片段的制备：用fliC-H1P1/fliC-H2P2，以pKD4质粒为模板，扩增两侧带有FRT位点的Kan的fliC打靶片段；
（3）FliC基因被Kan抗性基因替换：将打靶片段导入到含有pkD46的鼠伤寒沙门氏菌CVCC541的感受态中，利用Red同源重组技术敲除鼠伤寒沙门氏菌CVCC541基因组FliC基因片段；
（4）Kan的消除：将编码FLP重组酶的pCP20质粒导入到鼠伤寒沙门氏菌CVCC541fliC::Kan感受态中，诱导Kan的消除。
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