[发明专利]一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法

说明书

本发明提供一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法，包括下述步骤：(1)将沙门氏菌菌液，进行10,000×g，4℃，15min离心；(2)回收上清，不要将菌液沉淀倒出，进行13,000×g，4℃，15min离心；(3)回收上清，用PVDF膜滤器进行过滤2次；(4)将过滤的上清进行40,000×g，4℃，2h；弃去上清。本发明应用的高速离心的方案，用40,000×g的离心力成功的对鼠伤寒沙门氏菌的OMVs进行了提取。本发明还解决了鞭毛在OMVs提取物种大量存在的问题，本发明通过应用基因靶向编辑技术对鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛基因进行敲除，从而获得高纯度的OMVs。

技术领域

本发明涉及一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法。

背景技术

外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMVs)具有脂质双分子层的纳米级膜结构，大小在20-250nm之间，由革兰氏阴性菌天然产生。致病菌及非致病菌均能产生OMVs，含有菌体的大量成分，其中包含脂多糖(LPS)，周质及膜相关蛋白，酶类，毒素，DNA，RNA及肽聚糖。形成方式主要是由于蛋白错误折叠或外膜结构的破坏，外膜形成凸起，以出芽的形式输出。由于其产生与细菌的耐药，致病，生物被膜形成等相关，而且可以作为新兴的生物载体，因此，近些年来对其研究成为热点。

对于OMVs的研究的首要问题是如何简便的获取高质量的OMVs，目前对OMVs的提取的方法最主要的为超速离心法和密度梯度离心法。但这两种方法都需要用到超速离心机，超速离心时的转速在150,000×g左右，而超速离心机的容量是有限的并不适合大规模的提取，同时对于像鼠伤寒沙门氏菌这种具有丰富鞭毛成分的菌株，以上方法是无法对其进行有效的去除的，因此如何较为方便的获取纯度高的OMVs就成为一个难题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法，解决了超速离心的问题，本发明应用的高速离心的方案，用40,000×g的离心力成功的对鼠伤寒沙门氏菌的OMVs进行了提取。

本发明提供一种鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡的提取方法，包括下述步骤：

(1)将沙门氏菌菌液，进行10,000×g，4℃，15min离心；

(2)回收上清，不要将菌液沉淀倒出，进行13,000×g，4℃，15min离心；

(3)回收上清，用PVDF膜滤器进行过滤2次；

(4)将过滤的上清进行40,000×g，4℃，2h；弃去上清。

作为优选，步骤(3)中，所述PVDF膜滤器的规格为0.45μm。

作为优选，步骤(4)中，将弃去上清的沉淀物用0.01M的PBS进行重悬。

进一步优选，将弃去上清的沉淀物用0.01M的PBS进行重悬后，再用0.45μm PVDF滤器过滤，取滤液，进行40,000×g，4℃，2h的离心，弃去上清，用PBS进行重悬。

作为优选，步骤(1)中，所述沙门氏菌为敲除鞭毛基因的鼠伤寒沙门氏菌。

本发明还解决了鞭毛在OMVs提取物种大量存在的问题，本发明通过应用基因靶向编辑技术对鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛基因进行敲除，从而获得高纯度的OMVs。

作为优选，步骤(1)中，所述沙门氏菌为敲除fliC基因的鼠伤寒沙门氏菌。

作为优选，步骤(1)中，所述敲除fliC基因是通过Red同源基因重组技术敲除的。

本发明提供鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡fliC基因缺失株，其制备过程如下：

(1)设计引物：