[发明专利]一种鉴定水稻耐低磷基因Pup1的分子标记、鉴定方法及应用

权利要求书

1.一种鉴定水稻耐低磷基因Pup1的分子标记，其特征在于：所述分子标记为Pup1-M1，所述Pup1-M1为引物对，包括核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示的上游引物Pup1-M1-F和序列表SEQ ID NO.2所示的下游引物Pup1-M1-R。

2.根据权利要求1所述的一种鉴定水稻耐低磷基因Pup1的分子标记的获取方法，其特征在于：包括以下步骤：

通过登录号AB458444从Genbank下载Pup1基因的核苷酸序列，利用在线引物设计软件Primer1进行分子标记设计，获得权利要求1所述的分子标记。

3.一种利用权利要求1所述的分子标记鉴定水稻耐低磷基因Pup1的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、提取待测水稻品种的基因组DNA；

S2、以S1步骤中获取的基因组DNA为模板，以Pup1-M1-F和Pup1-M1-R为上下游引物进行PCR扩增；

S3、通过2％琼脂糖凝胶对S2步骤中获取的PCR产物进行电泳分离，经溴化已锭染色后将凝胶置于凝胶成像系统中成像；

S4、结果判定：观察S3步骤中的电泳图像，若能扩增出238bp大小的片段，则表明被检测水稻品种中携带有耐低磷基因Pup1；若无扩增片段出现，则表明被检测水稻品种中缺乏耐低磷基因Pup1。

4.根据权利要求3所述的分子标记鉴定水稻耐低磷基因Pup1的方法，其特征在于：所述水稻品种的基因组DNA采用CTAB法进行提取。

5.根据权利要求4所述的分子标记鉴定水稻耐低磷基因Pup1的方法，其特征在于：所述水稻品种基因组DNA的CTAB提取法，包括以下步骤：

Z1、将0.5g新鲜水稻叶片剪碎后装入2mL的离心管中，并往离心管内放入一粒钢珠，然后往其中加入600μL CTAB提取液，盖好管盖后置于打样机上以23～26r/s的速度振动1min；

Z2、65℃水浴30min，期间每隔10min震荡混匀1次；

Z3、打开离心管，加入600μL氯仿并充分摇匀，静置5min后以12000rpm的转速离心8min；

Z4、从Z3步骤的2mL离心管中吸取400μL上清液至事先准备好的1.5mL离心管中，然后往1.5mL离心管内加入1mL事先经过-20℃预冷的无水乙醇，摇匀后置于-20℃冰箱中静置20min，最后以12000rpm的转速离心10min；

Z5、将Z4步骤的1.5mL离心管中的液体倒掉，待离心管内的白色絮状沉淀风干后往其中加入200μL ddH₂O，轻轻摇晃使沉淀溶解得到水稻品种的基因组DNA，最后置于-20℃保存备用。

6.根据权利要求3所述的分子标记鉴定水稻耐低磷基因Pup1的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：10xPCR反应缓冲液2μL，浓度为5pM的Pup1-M1-F引物和Pup1-M1-R引物各1μL，10mM dNTP 0.5μL，25ng/μL DNA模板2μL，5U/μL TaqDNA聚合酶0.5μL，加ddH₂O补足至20μL。

7.根据权利要求3所述的分子标记鉴定水稻耐低磷基因Pup1的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35次循环；72℃再延伸10min，4℃冷却10min。

8.根据权利要求3所述的分子标记鉴定水稻耐低磷基因Pup1的方法，其特征在于：所述电泳分离的电压为120～130V，电泳时间为30～40min。

9.根据权利要求1所述的一种鉴定水稻耐低磷基因Pup1的分子标记在水稻耐低磷分子标记辅助育种中的应用。

10.根据权利要求3所述的分子标记鉴定水稻耐低磷基因Pup1的方法在水稻耐低磷分子标记辅助育种中的应用。