[发明专利]一种对映选择性提高的宇佐美曲霉环氧化物水解酶突变体

说明书

本发明公开了一种对映选择性提高的宇佐美曲霉环氧化物水解酶突变体，属于酶工程和生物催化技术领域。本发明基于理性设计对宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)环氧化物水解酶(AuEH2)进行分子改造，结合基因的定点饱和突变方法，获得多个对映选择性提高的环氧化物水解酶突变体。本发明获得的9个对映选择性提高的突变体催化外消旋对甲基苯基缩水甘油醚(rac‑pMPGE)的对映体比率(E值)相比野生型，从12.7分别提高至32.4、31.1、27.8、25.8、23.5、22.4、20.2、14.1、13.6。

技术领域

本发明涉及一种对映选择性提高的宇佐美曲霉环氧化物水解酶突变体，属于酶工程和生物催化技术领域。

背景技术

手性环氧化物和邻二醇是合成手性药物、农业、香料及精细化工等行业各种活性物质的重要中间体，具有广阔的应用前景和市场需求。光活性的手性化合物具有不同于外消旋体的独特性质，其在生物体内的代谢途径、代谢速率、药理及毒性等方面的差异，使其在化学和生命科学产业有着崭新和特殊的用途。20世纪60年代，震惊世界的“反应停事件”已经充分说明获得光学纯化合物的必要性。传统的化学法拆分环氧化物往往需要重金属类有毒物质作为催化剂，不仅面临着环境的巨大挑战，且很难获得高产率的手性纯化合物。环氧化物水解酶(Epoxide hydrolases,EHs)是一类催化水分子立体选择性的加成环氧化物水解为相应1,2- 二醇的水解酶类，是一种典型α/β折叠型水解酶。然而，不同来源的EHs的性质均存在很大的差异，自然界筛选到的具有EHs活性的微生物往往存在产酶活低、对映选择性较低及稳定性差等缺陷，往往不能满足工业化应用的需求。

目前，研究较多的微生物EH主要来自于黑曲霉(Aspergillus niger)、黏红酵母(Rhodotorula glutinis)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter AD1)、鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonas sp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，这些EH对一些特定的底物具有较高的催化活性和高对映选择性。近年来，分子生物学技术，如定点突变、饱和突变、错易PCR和DNA shuffling等也用于改造EHs的催化活性、稳定性、对映选择性等性质，并通过高通量筛选获得优良突变酶。

目前已有宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)来源的环氧化物水解酶(AuEH2)在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中实现异源表达的技术方案(公开于公开号CN102994470A的专利申请中)，该环氧化物水解酶可对映选择性水解动力学催化多种环氧化物制备高光学纯的手性环氧化物 (J Ind Microbiol Biotechnol,2015，42(5):671-680)。但该重组酶对环氧化物的对映选择性并不高，从而限制了其在高附加值药物前体的手性合成中的应用潜力。

发明内容

针对现有技术存在的上述缺陷，本发明要解决的第一个技术问题是提供一种对映选择性提高的环氧化物水解酶(AuEH2)突变体，所述突变体是(a)或(b)：

(a)在SEQ ID NO.1所示序列基础上，将第250位丙氨酸(A)突变为组氨酸(H)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、或脯氨酸(P)；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体或细胞。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述AuEH2突变体的基因工程菌，以pET系列质粒为载体，以大肠杆菌为宿主，表达所述环氧化物水解酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主是E.coli BL21(DE3)。