[发明专利]一种适合质谱检测的样本前处理组合物、样本前处理方法及应用

说明书

本发明涉及适合质谱检测的样本前处理组合物、样本前处理方法及应用，通过本发明提供的样本前处理方法可以准确分离样本中的目标糖基化蛋白，富集的糖基化蛋白无需其他处理，可以直接上质谱检测，为质谱检测分析提供简便的前处理方法，使质谱分析仪可以对肿瘤、自身免疫疾病等相关疾病进行筛查及检测，本发明对质谱检测具有重要意义，具有极高的灵敏度，方法快速简便而且易于自动化。

技术领域

本发明属于医疗器械及体外诊断的技术领域，涉及一种适合质谱检测的样本前处理组合物、样本前处理方法及应用。

背景技术

质谱检测(mass spectrometry，MS)的基本原理是：使分子或原子等粒子在离子源中发生电离，并在加速电场的作用下，让所发生电离对的分子或原子进入质量分析器，利用电场、磁场使各种离子按质荷比发生色散和聚焦，从而确定其质量，并根据质量及图谱分析确定待测样品的类型和数量。

从20世纪40年代开始，质谱广泛用于有机物质分析，并相继出现了气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术、场解析(FD)技术、等离子体解析(PD)技术、快速原子轰击(FAB)、热喷雾(TS)等离子化技术，实现了对复杂混合物、极性较大的生物分子的分析和鉴定，可分析和鉴定的相对分子质量范围达到了千道尔顿(KDa)级别及以上。

电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解析电离(MALDI)两大软电离技术的实现，使蛋白质、核酸和聚糖这样高极性、难挥发、热不稳定、质量可高达几十万的生物大分子高效、持续、稳定地生成准分子离子；电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解析电离(MALDI)与离子阱质谱分析仪(IT)、三重串联四极杆质谱分析仪(QQQ)、飞行时间质谱分析仪(TOF)和傅里叶变换离子回旋共振质谱分析仪(FTICR)等高性能质谱分析器联合使用后，可以实现生物大分子的质谱分析、定量分析和相对分子质量测定，并且检出限可达到皮摩尔级(ppm)甚至更低。

糖基化是蛋白质形成过程中一种最常见的蛋白翻译后修饰，人体样本中50％以上的蛋白都具有糖基化修饰，其对蛋白的结构和功能有着重要影响。其中两种主要类型的糖基化为：N-糖基化和粘蛋白型O-糖基化。其中：

1、N-糖基化蛋白的N-糖基化发生在蛋白特征序列Asn-Xaa-Ser/Thr，即N-X-S/T，糖链的还原末端通过Asn的侧链氨基与蛋白质相连。N-糖链由五糖核心和分支(或天线)两部分构成，其中，五糖核心由两个乙酰葡糖胺(GlcNAc)和三个甘露糖(Man)组成，某些情况下，还原末端的乙酰葡糖胺(GlcNAc)还会与一个岩藻糖(Fuc)连接，形成核心岩藻糖结构。五糖核心通常连接2-4条分支，根据分支类型的不同，N糖基化蛋白细分为三种亚型，即：高甘露糖型、复杂型和杂合型。其中：(1)高甘露糖型N糖基化蛋白的糖链分支均由甘露糖组成；(2)复杂型N糖基化蛋白的糖链分支由乙酰葡糖胺、半乳糖(Gal)、唾液酸(Sia)等单糖按照特定的顺序依次连接而成；(3)杂合型N糖基化蛋白的糖链分支同时含有上述两种分支。

2、O-糖基化蛋白的O-糖基化发生在氨基酸残基Ser/Thr上，糖链还原末端与Ser/Thr的侧链羟基相连。与N-糖基化蛋白相比，O-糖基化蛋白的糖基化位点不具有保守性的蛋白特征序列，且存在多种核心结构。O-糖基化蛋白的糖链的单糖组成较为简单，但连接方式和亚型多，因此结构更为复杂，常见O-糖基化蛋白有以乙酰半乳糖胺(GalNAc)为还原末端的O-糖基化蛋白。

大量研究发现，异常的糖基化现象往往与疾病密切相关，包括癌症和先天性糖链缺陷等。糖基化修饰过程中形成的糖链结构异常蛋白已经被确定为病毒性疾病、糖尿病、自身免疫疾病、癌症、遗传性疾病等疾病的一种标志物，它在疾病的发生、进展和转移方面具有重要意义，也为疾病诊断和研究提供了一个新的诊断方法。目前，已发现的糖链结构异常蛋白包括：用于肝癌的AFP，用于卵巢癌的CA125，用于结肠癌的CEA和用于前列腺癌的PSA、与聚糖相关的标志物例如CA19-9、转铁蛋白、碱性磷酸酶、r-谷氨酰转移酶、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、T抗原、a1抗胰蛋白酶、前列腺酸性磷酸酶、结合珠蛋白、免疫球蛋白IgG、球蛋白A、血浆铜蓝蛋白等。