[发明专利]用于识别低密度脂蛋白的酸性状态及糖化状态的检测试剂及试剂盒

说明书

本发明提供一种用于全面地检测低密度脂蛋白的氧化状态及糖化状态的检测试剂。更详细的，根据本发明，在使用发色团标记抗体来检测氧化低密度脂蛋白及糖化脂蛋白的同时，使用荧光氮氧自由基2,2,6‑三甲基‑4‑(硝基苯并[1,2,5]噁二唑‑7‑基氨基)‑6‑戊基哌啶‑1‑氧基(NBD‑Pen)来检测脂质自由基。

技术领域

本发明涉及可视化地检测氧化及糖化脂蛋白的技术。更具体地，本发明提供用于通过荧光观察来检测低密度脂蛋白中的脂质的氧化状态及蛋白质的糖化状态的检测试剂及试剂盒。

背景技术

近年来，已经发现脂质的氧化、糖化会促进衰老。已知受到氧化、糖化等变质的脂质与各种疾病相关，通过查明这种脂质的变质(氧化及糖化)的产生原因，使其不仅在防止老化、美容领域，在疾病的预防及治疗方面也发挥用处的研究越来越多。

超氧阴离子基团、羟基自由基、过氧化氢及单态氧等活性氧簇(ROS)影响生物体内的各种现象，其中，已知羟基自由基的反应性极强，会带来各种疾病，正在积极地对其进行研究。已将发现这种羟基自由基作用于脂质而生成脂质自由基(lipid radical)。

由于脂质自由基反应性高且不稳定，因此生成脂质自由基时会连锁地发生脂质过氧化反应，产生脂质过氧化物，进而生成作为代谢产物的亲电性化合物。脂质含有许多不饱和脂肪酸，由于其活性亚甲基部分的氢原子被夺走，因此容易受到自由基的攻击，诱发由反应式(a)～(c)示出的过程所构成的脂质过氧化连锁反应(图1)。

(式1)

LH+R·→L·+RH (a)

LOO·+LH→LOOH+L· (c)

自由基(R·)从不饱和脂肪酸(LH)夺走氢元素，开始连锁反应(a)；利用所生成的脂质自由基(L·)与氧分子的反应，来生成脂质过氧自由基(Lipid peroxyl radical)(LOO·)(b)；而后，脂质过氧自由基从周围的不饱和脂肪酸夺走氢原子，生成过氧化脂质(LOOH)和脂质自由基(L·)(c)。在再生的脂质自由基(L·)的作用下，开始下一次的连锁反应循环。

关于过氧化脂质(LOOH)，可转化为以丙二醛、4-羟基-2-壬烯醛、丙烯醛、丙醛、乙二醛为首的数百种以上的亲电性化合物作为其代谢产物。

已经发现这些代谢产物单独地、或者形成与蛋白质的复合体后，各自具有细胞毒性、炎症、致突变性。

在生物体内，不溶于水的脂质与载脂蛋白结合而形成脂蛋白。此外，形成细胞膜所必须的胆固醇也不溶于水，同样地与载脂蛋白结合。根据比重，脂蛋白被分类为高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等。

特别是LDL中的脂质(图2a)在ROS等的作用下生成脂质自由基，并经由过氧化脂质而生成代谢产物。如此，将只有脂质受到氧化变质状态的LDL(oxidized-state LDL)称为轻度修饰LDL(minimally modified oxidized LDL；MM-LDL)(图2b)。进而，生成的代谢产物通过LDL中的蛋白质的赖氨酸残基、精氨酸残基来进行结合，成为所谓的氧化修饰LDL(oxidized LDL；OxLDL)(图2c)。

如图3所示，通过大量的研究已将发现这种氧化修饰LDL会引起以年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration；AMD)、动脉硬化为首的各种疾病(例如，非专利文献1、2等)。