[发明专利]α-转氨酶及突变体以及在不对称合成L-草铵膦中的应用

说明书

本发明公开了一种新型转氨酶及其高活力突变体在制备L‑草铵膦中的应用，转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID:5所示，其突变体是将SEQ ID:5所示的氨基酸序列的第124、144、237、250、和328位中的一个或者多个进行单位点突变或多位点突变获得的。本发明实现高转化率转氨酶活力突变体基因的高效表达，酶活最高为840U/mg。本发明中所述转氨酶突变体的最适反应温度最高达到67℃，在该温度下催化800mM草铵膦前体酮利用无机胺正丁胺不对称合成L‑草铵膦中，转化率高达100％。该AcTA突变体解决了当前转氨酶制备L‑草铵膦工艺中，酶源少、酶活低、底物耐受性和氨基供体昂贵等技术难题，具有较好应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及一种新型转氨酶及其高活力突变体，及其在不对称合成L-草铵膦中的应用。

(二)背景技术

草铵膦，4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸(phosphinothricin,PPT)，为广谱、触杀型、灭生性、非残留的除草剂，具有高效、低毒、易降解等特点。PPT是外消旋体混合物，包含两种光学异构体，但只有L-型具有植物毒性。自除草剂草甘膦退出农药市场，制备光学纯L-PPT获得前所未有的市场机遇。

制备光学纯L-PPT主要有化学合成法、手性拆分法和不对称合成法。化学合成法工艺步骤繁多，所需要的合成试剂价格昂贵，导致成本投入高，而且部分试剂对环境和人体都有一定的毒害作用，无法满足当今的绿色环保要求。手性拆分制备光学纯L-PPT过程用到手性试剂，拆分收率最高仅为50％，得到的D-PPT需要消旋后再利用，手性拆分过程复杂。

不对称合成法具有立体选择性严格、反应条件温和，收率高以及容易分离纯化等优点，适用于大规模制备L-PPT。催化此类反应的酶主要包括谷氨酸脱氢酶和转氨酶，底物为草铵膦前体酮(2-羰基-4-(羟基甲基磷酰基)-丁酸，PPO)。脱氢酶催化时，需要使用昂贵的NAD(P)H作为辅助因子，催化成本过高。

转氨酶(transaminase，简称TA，EC 2.6.1.X)，是一种吡哆醛5'-磷酸(PLP)依赖型酶，它催化氨基从合适的供体到羰基受体的可逆转移。根据氨基被转移到不同的氨基受体位置，可以分为α-TA和ω-TA。α-TA催化底物α位置的羰基接受氨基供体的氨基转移反应，ω-TA催化底物ω位置的羰基接受氨基供体的氨基转移的反应。原则上，TA可以催化转化众多结构的酮和胺，因此TA具有更高的应用前景和价值。

目前，已有一些α-TA已制备L-PPT的报道。Schulz等在大肠杆菌K-12中得到的转氨酶在制备L-PPT，固定化后底物浓度为550mM时转化率可以达到76％(Schulz A,TaggeselleP,Tripier D,et al.Stereospecific production of the herbicide phosphinothricin(glufosinate)by transamination:isolation and characterization of aphosphinothricin-specific transaminase from Escherichia coli..AppliedEnvironmental Microbiology,1990,56(1):1.)。Bartsch等人从土壤中筛选得到天冬氨酸转氨酶并应用于制备L-PPT，当以天冬氨酸为氨基供体，底物浓度为40mM时转化率最高可以达到75％，底物浓度为100mM时转化率为59％(K.Bartsch,Process for the preparationof L-phosphinothricine by enzymatic transamination with aspartate,U.S.Patent(2005)6936444.)。现有的转氨酶工艺存在的问题是酶源少、酶活性低、转化率低、氨基供体昂贵。

在此背景下，本发明提出通过基因挖掘技术筛选新型TA重组酶，并通过蛋白质工程技术进行分子改造，将具有活性和底物耐受性提高的TA突变体催化剂用于不对称合成制备L-PPT，对于改善TA在制备L-PPT过程中底物耐受性差、酶活低、催化成本高具有重要意义。