[发明专利]基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法

权利要求书

1.一种基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，包括：

识别探针，由四条探针A、B、C、D自组装形成，A、B、C、D均包含相互杂交的序列，自组装形成DNA四面体结构，其中A包含特异性识别并结合目标生物靶标分子的核酸适配体序列apt，所述apt位于A的5’端，B包含与apt的部分序列互补的a序列，所述a序列位于B的5’端，所述apt和a序列不参与构建DNA四面体结构，a序列长度为20-28nt；

发夹探针，包括H1和H2，H1依次包括H1b、H1a’、H1c三个部分，其中H1b部分序列与传感界面探针互补，H1a’的部分序列与H1c 的部分序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，H1a’为a序列的互补序列；H2依次包括H2a和H2c’两个部分，其中H2a的部分序列和H2c’的部分序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，H2a与H1a’互补，H2c’与H1c互补；

或者H1依次包括H1a’和H1c两个部分，其中H1a’的部分序列与H1c 的部分序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，H1a’为a序列的互补序列；H2依次包括H2b、H2a和H2c’三个部分，其中H2b部分序列与传感界面探针互补，H2a的部分序列和H2c’的部分序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，H2a与H1a’互补，H2c’与H1c互补；

H1a’、H1c、H2a、H2c’序列长度均为20-28nt，H1b或H2b序列长度为10-16nt；

所述H1或H2的5’端标记有生物素或荧光基团；

辅助探针，与H1b的部分序列以及H1a’的部分序列互补；或者与H2b的部分序列以及H2a的部分序列互补；辅助探针序列长度均为10-16nt；

金界面上自组装有捕获探针的电极或芯片，所述捕获探针由4条探针E、F、G、H自组装形成，E、F、G、H均包含相互杂交的序列，自组装形成DNA四面体结构，其中E包含与H1b或H2b互补的Eb’序列，Eb’序列位于E的5’端，所述Eb’序列不参与构建DNA四面体结构；F、G、H均有巯基修饰；

识别探针、发夹探针、辅助探针和捕获探针为DNA；

利用所述生物靶标分子检测传感器的生物靶标分子检测方法，包括以下步骤：

(1)合成识别探针；

(2)合成发夹探针、辅助探针及捕获探针；

(3)基于杂交链式反应多价捕获进行生物靶标分子检测：往待测溶液中加入识别探针、发夹探针H1、H2，混合，室温下反应，形成杂交链反应产物，再加入辅助探针，然后将金界面上自组装有捕获探针的载体置于反应溶液中，将杂交链反应产物捕获到金片上，最后分析金界面上的信号标记变化，进而计算出待测样本中目标生物靶标分子的含量。

2.如权利要求1所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，H1b或H2b、辅助探针的长度为12nt，H1a’、H1c、H2a、H2c’序列长度均为24nt，其中发卡结构的茎部序列长度为18bp。

3.如权利要求1所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，所述的信号标记为生物素或荧光基团。

4.如权利要求1所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，所述目标生物靶标分子为外泌体、DNA、RNA、药物/生物小分子、生物体内金属离子、抗原、抗体、酶或肿瘤细胞。

5.如权利要求1所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，所述待测溶液的缓冲体系为SPSC缓冲溶液。

6.如权利要求1所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，步骤(3)中，识别探针、H1、H2、辅助探针的工作浓度为1nM-20μM。

7.如权利要求1所述的基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，当目标生物靶标分子为乳腺癌细胞分泌外泌体时，以外泌体膜表面上皮细胞粘附分子为特异性识别目标，apt的序列如SEQ ID NO.1所示，H1的序列如SEQ ID NO.2所示，H2的序列如SEQ ID NO.3所示，辅助探针的序列如SEQ ID NO.4所示。