[发明专利]基于随机扩增标记和原位合成微流体芯片的水产病原微生物检测方法

权利要求书

1.原位合成微流体芯片，其特征是：原位合成微流体芯片由895条寡核苷酸探针组成，所述895条寡核苷酸探针包含42条阳性/阴性对照探针，序列如表1所示；

表1、水产病原微生物芯片检测探针

2.利用权利要求1所述的原位合成微流体芯片进行的非疾病诊断目的的水产病原微生物检测方法，其特征是包括以下步骤：

1)、制备寡聚核苷酸芯片；

2)、随机扩增法标记病原微生物基因片段；

3)、芯片杂交；

4)、根据杂交结果判定样品中是否含有水产病原微生物。

3.根据权利要求2所述的水产病原微生物检测方法，其特征是，所述步骤2)包括以下步骤：

①、取水产样品0.2g，提取总DNA和总RNA；

②、总RNA利用反转录试剂盒合成第一链cDNA，并利用ssDNA连接酶连接环化；

③、所得的环化产物经清洁回收后，用phi29聚合酶30℃随机等温扩增2h，扩增所用的引物为5′-GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN-3′；

④、扩增产物随即进行第二轮PCR反应，PCR反应的引物为5′-GTTTCCCAGTCACGATC-3′，反应体系中设定Cy3标记的dCTP，以此对产物进行Cy3荧光标记；

⑤、带Cy3荧光标记的第二轮PCR产物经DNase I消化，并剪切为50～500bp的小片段。

4.根据权利要求3所述的水产病原微生物检测方法，其特征是，所述步骤3)为：

将Cy3标记的病原微生物基因片段与杂交缓冲液等体积混合，95℃变性5min后迅速置于冰上预冷3min；再加入到进样管中，32℃，双向循环杂交2-4h，流速为500μL/min；

杂交结束后，用Wash buffer 40℃循环清洗；

循环清洗结束后，取出芯片，以Microarry Scanner Genepix 4000B扫描，扫描分辨率为10μm，波长为532nm，读取扫描结果，保存图片；

所述杂交缓冲液为6×SSPE，25％甲酰胺，pH 6.6-6.8；

所述Wash buffer为：500μL杂交缓冲液,480μL H₂O,20μL 10％SDS。

5.根据权利要求4所述的水产病原微生物检测方法，其特征是，所述步骤4)为：

用芯片分析软件获取每个探针的荧光信号强度和标准误，信号值经过背景噪音减除后，通过调整该扫描通道下的平均信号值到同一水平对数据进行归一化处理；

最后根据各个检测基因、参照基因以及芯片质控探针的信号值，分析芯片杂交结果的可信度，判断该检测样品中是否含有水产病原微生物，以及病原微生物的种类。

6.根据权利要求5所述的水产病原微生物检测方法，其特征是，所述步骤4)为：

每条探针设置4个重复；

针对每个检测基因，当有3条以上的探针信号强度超过500、而且4个重复之间的信号标准差小于50％时，判定该基因被检出；当针对同一病原微生物的多个基因被检出，认为该病原微生物存在于样品。