[发明专利]基于随机扩增标记和原位合成微流体芯片的水产病原微生物检测方法

说明书

本发明公开了一种原位合成微流体芯片，为895条寡核苷酸探针，包含42条阳性/阴性对照探针，具体如表1所述。本发明还同时提供了利用上述原位合成微流体芯片进行的水产病原微生物检测方法，包括以下步骤：制备寡聚核苷酸芯片；随机扩增法标记病原微生物基因片段；芯片杂交；根据杂交结果判定样品中是否含有水产病原微生物。本发明利用该芯片的高通量检测能力，和随机扩增法简便、高效的特性，对我国水产养殖动物的主要病原微生物的保守基因和变异基因片段进行快速平行检测。

技术领域

本发明涉及水产病原微生物的检测和鉴定方法，尤其涉及利用随机扩增标记法和原位合成微流体芯片技术检测水产病原微生物的方法。

背景技术

近年来,我国渔业生产取得了迅猛发展，在农业产值中所占的比重稳步上升，已成为现代农业的四大支柱产业(粮食、肉类、水产和禽蛋)之一。水产养殖业也呈现出养殖规模和养殖技术的空前提高，尤其在集约化养殖和工厂化养殖方面发展迅速。但在目前高密度化、集约化、多品种混养的养殖环境和模式下，各种水产养殖动物病害频发,给养殖者造成了重大损失，已成为制约该产业健康、持续、快速、稳定发展的重要因素之一。例如，根据《2016年浙江省水产养殖病害形式分析》报告，2016年浙江省全省21个水产养殖监测品种中有18个品种全部发病，病害种类达60种，其中包括病毒性疾病5种、细菌性疾病24种、真菌性疾病3种、寄生虫性疾病12种、非生物源病害16种，造成5000万元以上的直接经济损失，这还不包括因为病害威胁导致的生产收缩和产品质量安全下降所带来的损失。

水产病害的频发导致渔药滥用问题突出，这不但使水产品的质量安全受到严重的影响，也造成了更为严重的环境污染问题。此外，还导致病原细菌、病毒的变异和重组几率大大增加，以及新的生物源性病害出现。例如，近年对虾养殖过程中比较严重的“偷死症”(“死底症”)曾造成2010年华南地区南美白对虾养殖业20年来最严重的灾难(死亡率达80％以上)，然而到现在人们尚不明确其病因，比较流行的说法是弧菌感染、新病毒的爆发或养殖水环境的恶化。这反映了目前所用的传统病原微生物分离培养及症状观察，已难以满足实际生产需要。并且针对单一(或少数)病原的检测和诊断不能全面反映病害发生的原因和状况，不利于制定有效的防治措施。

及时、准确、高效的监测病原微生物的种类、了解其流行和分布特征是有效控制养殖动物的病害传播、针对性的安全合理用药的首要条件。随着分子生物学相关学科的迅速发展，越来越多的病原微生物基因序列得到测定，水产病害相关领域数据库的信息量迅速增加，使基因芯片在水产动物病毒诊断领域的应用基础已经完全具备，为解决上述问题提供了新思路。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种原位合成微流体芯片，以及一种基于随机扩增法的病原基因片段扩增和标记方法。本发明利用该芯片的高通量检测能力，和随机扩增法简便、高效的特性，对我国水产养殖动物的主要病原微生物的保守基因和变异基因片段进行快速平行检测。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种原位合成微流体芯片，原位合成微流体芯片包含了895条寡核苷酸探针，所述895条寡核苷酸探针包含42条阳性/阴性对照探针，序列如表1所示；

表1、水产病原微生物芯片检测探针