[发明专利]用于切割靶DNA的组合物及其用途

权利要求书

1.II型成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9组合物，用于修饰植物细胞中的靶DNA，其中靶DNA是内源基因组DNA，其中所述组合物包含：

Cas 9-向导RNA复合物，其包括：

a)编码Cas9多肽和核定位信号(NLS)的核酸，或其上连接有NLS的Cas9多肽；

b)向导RNA，其中向导RNA是：

(i)dual向导RNA，其包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)，crRNA的一部分与靶DNA杂交，其中crRNA和tracrRNA彼此不融合，或者

(ii)单链向导RNA(sgRNA)，其包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)，crRNA的一部分与靶DNA杂交，其中crRNA和tracrRNA彼此融合；和

c)用于转染植物细胞的转染缓冲液。

2.权利要求1的组合物，其中转染包含聚乙二醇(PEG)。

3.权利要求2的组合物，其中转染缓冲液是40％PEG转染缓冲液。

4.权利要求3的组合物，其中40％PEG转染缓冲液包含40％PEG4000，200mM甘露糖醇和100mM CaCl₂。

5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述组合物不包含DNA。

6.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述组合物不包含外源DNA。

7.权利要求1-6中任一项的组合物，其中靶DNA的修饰是在靶DNA中诱导indel。

8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中Cas9多肽是化脓性链球菌(Streptococcuspyogens)Cas9多肽。

9.一种修饰植物细胞中靶DNA的方法，其中靶DNA是内源基因组DNA，所述方法包括：

I)制备包含Cas9-向导RNA复合物的组合物，其包含：

a)编码Cas9多肽和核定位信号(NLS)的核酸，或其上连接有NLS的Cas9多肽，和

b)向导RNA，其中向导RNA是：

(i)dual RNA，其包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)，crRNA的一部分与靶DNA杂交，其中crRNA和tracrRNA彼此不融合，或者

(ii)单链向导RNA(sgRNA)，其包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)，crRNA的一部分与靶DNA杂交，，其中crRNA和tracrRNA彼此融合；

和

II)使用转染缓冲液将组合物引入植物细胞中以转染植物细胞。

10.一种在植物细胞中在靶DNA的不同链中引入两个切口的方法，其中靶DNA是内源基因组DNA，所述方法包括将以下引入植物细胞中：

a)编码Cas9多肽和核定位信号(NLS)的核酸，或其上连接有NLS的Cas9多肽，其中Cas9多肽是Cas9切口酶，和

b)两种向导RNA，其中两种向导RNA中的每一种的一部分与靶DNA的一条链杂交，并且其中向导RNA是：

(i)双向导RNA，其包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)，crRNA的一部分与靶DNA杂交，其中crRNA和tracrRNA彼此不融合，或者

(ii)单链向导RNA(sgRNA)，其包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)，crRNA的一部分与靶DNA杂交，其中crRNA和tracrRNA彼此融合。