[发明专利]一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法

权利要求书

1.一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)通过磁珠介导在磁珠表面修饰核酸适配体；所述核酸适配体用于特异性结合目标物；所述核酸适配体为寡核苷酸序列，核酸适配体的碱基序列为：ACGGTTGCAAGTGGGACTCTGGTAGGCTGGGTAATTTGG；

2)将修饰好的磁珠-核酸适配体溶液与被测样品混合孵育，并进行提取磁分离；所述的被测样品为甲基苯丙胺；

3)孵育后利用新型定位探针进行介导剪切，所述选择性定位探针的序列为CCAAATTACCCAGCCTACCAGACTCACGTTTTTCGTGAGT；加入限制性核酸内切酶，将未与样品结合的核酸适配体的目标片段剪切下来并进行检测磁分离；所述的新型定位探针为非对称发卡状DNA；没有3’端的侧臂，且3’端的茎上缺少一个碱基；茎上含有限制性核酸内切酶的不完整识别位点；当核酸适配体与目标物结合时呈核壳结构，所述新型定位探针无法与核酸适配体结合；未与目标物结合的核酸适配体呈初始线形结构，在特定位置将暴露碱基；所述不完整识别位点即可与核酸适配体利用碱基互补配对形成完整的识别序列；在限制性核酸内切酶的作用下快速剪切核酸适配体，获得所需的目标片段；所述的限制性核酸内切酶为切口内切酶Nt.BstNBI；

4)将被剪切下的目标片段进行体外扩增，根据实时荧光的信号出峰时间进行浓度检测，剪切得到的目标片段浓度越大，出峰时间越短。

2.根据权利要求1所述的一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，其特征在于，所述的核酸适配体用生物素修饰，磁珠由链霉亲和素修饰；通过链霉亲和素和生物素的特异性结合把核酸适配体接到磁珠表面，得到磁珠-适配体溶液。

3.根据权利要求1所述的一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，其特征在于，所述的混合孵育过程包括：将修饰好的磁珠-核酸适配体溶液与磷酸缓冲盐溶液、被测样品混合，室温静置至多30min，使被测样品中的目标物与磁珠上的核酸适配体特异性结合。

4.据权利要求1所述的一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，其特征在于，所述的介导剪切过程需要在50～55℃的恒温条件下进行。

5.根据权利要求1所述的一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，其特征在于，所述的提取磁分离过程包括：利用引入的磁场进行磁珠提取，带有适配体的磁珠将目标物从复杂样品中分离。

6.根据权利要求1所述的一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，其特征在于，所述的检测磁分离过程包括：利用引入的磁场进行磁珠提取，将磁珠与目标片段进行分离。

7.根据权利要求1所述的一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，其特征在于，所述体外扩增包括PCR扩增或等温扩增。