[发明专利]一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法

说明书

本发明公开的一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，属于分析检测领域。利用磁珠介导在样品中实现特异性分离，不需要样品前处理。磁珠表面定量连接待测目标物的适配体，实现自适应超高灵敏一体化检测技术，可以实现高通量标准化的检出模式。新型选择性定位探针，实现对目标序列的可编程的任意位点剪切，可以通过凝胶电泳/核酸体外扩增完成整个检测分析过程。将被剪切下的目标片段直接通过凝胶电泳测定，或进行体外扩增，根据实时检测信号的出峰时间进行浓度测量，且本发明方法在复杂的人体体液样本中检测效果良好，可以成功检测浓度低达10^‑12M的甲基苯丙胺‑血清溶液。

技术领域

本发明涉及分析检测领域，特别涉及痕量、超痕量组分的基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法。

背景技术

分析检测过程中，样品前处理技术过程操作复杂、繁琐，成本高昂，处理过程需要消耗大量人工，需要消耗大量对人体或环境有毒有害溶剂萃取样品，因此前处理技术发展滞后是制约现代分析技术的重要因素，近年来分析工作者发明了如液—液微萃取、自动索氏提取、吹扫捕集、微波辅助萃取、超临界流体萃取，超声波萃取，固相萃取、固相微萃取、顶空法、膜萃取、加速溶剂萃取等，但是这些方法需要购置昂贵的仪器，而且部分方法虽然实现了自动化但分离萃取原理不变因此效率仍旧不高。随着社会经济发展，人们寿命增长和生活质量提高，人们对于环境质量、食品安全、医疗检测的要求也越来越高，对痕量样品分析高效，准确地检测的需求也应运而生。传统的检测的方法主要有气相色谱法(GC)，气相色谱与质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)等。这些方法分离效率高，检测性能好，分析时间相对较短，但是不能直接给出定性结果，需要与已知标准品对照确定，操作复杂，设备昂贵。化学试剂显色法虽然反应时间快，操作简单，可应用于现场检测，但是其灵敏度不高。目前使用核酸适配体的生物传感技术连接核酸适配体的位置空间位阻大，探针不易连接导致其灵敏度不高，不能作为标准检测方法。

目前现有的技术的缺陷是：样品前处理过程操作繁琐、成本高。分析检测过程成本高、特异性差、检测灵敏度不够高难以满足痕量样品检测的需求，难以做到标准检测。

而本发明提供了一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法。具有无需样品前处理、快速分离并高特异性检测复杂体系中目标物、检测信号自适应放大、可完成高灵敏一体化标准检测等优点。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，利用该方法可以进行复杂样品的高灵敏度痕量、超痕量检测。

本发明基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，包括如下步骤：

1)通过磁珠介导在磁珠表面修饰核酸适配体；所述核酸适配体用于特异性结合目标物；

2)将修饰好的磁珠-核酸适配体溶液与被测样品混合孵育，并进行提取磁分离；

3)孵育后利用新型定位探针进行介导剪切，加入限制性核酸内切酶，将未与样品结合的核酸适配体的目标片段剪切下来并进行检测磁分离；所述的新型定位探针为非对称发卡状DNA；没有3’端的侧臂，且3’端的茎上缺少一个或两个碱基；茎上含有限制性核酸内切酶的不完整识别位点；当核酸适配体与目标物结合时呈核壳结构，所述新型定位探针无法与核酸适配体结合；未与目标物结合的核酸适配体呈初始线形结构，在特定位置将暴露碱基；所述不完整识别位点即可与核酸适配体利用碱基互补配对形成完整的识别序列；在限制性核酸内切酶的作用下快速剪切核酸适配体，获得所需的目标片段；

4)将被剪切下的目标片段进行体外扩增，根据实时荧光的信号出峰时间进行浓度检测，剪切得到的目标片段浓度越大，出峰时间越短。

作为本发明的一种优选方案，所述的核酸适配体是一段基于目标物体外筛选获得的寡核苷酸序列或者多肽。