[发明专利]一种DHBV DNA聚合酶提取及活性检测的新方法

权利要求书

1.一种DHBV DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于：

第一、Oligo(dT)₁₅包被板的制备：

将Oligo(dT)₁₅溶于100mM的1-甲基-咪唑pH为7.4的磷酸盐缓冲液PBS中，加入96孔酶标板中，与水溶性碳化二亚胺混匀，于50℃水浴中反应4小时，反应结束后用洗液Ⅰ洗三遍，除去未结合的Oligo(dT)₁₅，将包被后的96孔板置4℃保存；

第二、DHBV聚合酶活性检测步骤：

1)洗净的96孔酶标板中加入每孔10μL PBS，然后加入每孔70μL的RT Buffer和每孔20μL的含DHBV DNA聚合酶的PBS溶液，使反应系统总体积为100μL，然后37℃水浴1h；

2)用洗液Ⅱ洗三次，除去未结合的游离底物，再每孔加入100μl 1％小牛血清白蛋白(BSA)，室温封闭60min；

3)用洗液Ⅱ洗板，每孔加入50μL的100ng/mL的碱磷酶标记链霉卵白素(SA-ALP)稀释液，37℃水浴1h；

4)用洗液Ⅱ洗板，每孔加入100μL pH9.5的对硝基苯磷酸二钠(PNPP)，37℃水浴30min；

5)酶标板中每孔加入50μL 1mol/L的NaOH终止反应，酶标仪测定405nm波长处A值，以吸光度OD值确定DHBV聚合酶的活性；

判断DHBV聚合酶活性标准：由于OD值在紫外光下检测的有效测定范围0.1～1.0，所以本方法中DHBV聚合酶检测的OD值在1.0左右，显示该酶活性较强；若OD值低于0.1，则认为该酶已经失去活性。

2.根据权利要求1所述的DHBV DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于：所述的洗液原料配比为：

洗液Ⅰ：50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；

洗液Ⅱ：50mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.15mol/L NaCl，0.05mmol/L MgCl₂，0.02％吐温20。