[发明专利]一种DHBV DNA聚合酶提取及活性检测的新方法

说明书

本发明公开一种DHBV DNA聚合酶活性检测的新方法。其主要特征在于：Oligo(dT)₁₅包被板的制备和DHBV聚合酶活性检测步骤。本发明DHBV聚合酶的活性测定方法的稳定性和重现性比较好，解决了在HBV DNA聚合酶的活性研究方面无法有效开展相关工作两大难题：(1)不具备提取HBV DNA聚合酶的条件和方法；(2)没有适合的方法检测HBV DNA聚合酶活性。并用实际的应用案例证实了本发明的实用性。

技术领域

本发明属于分子生物学方面的新型检测方法，主要应用于乙肝病毒(HBV)的机理学研究方面，适用于科研机构及院校工作研究者对乙肝病毒(HBV)方面的深入研究。

背景技术

1.DHBV聚合酶的提取

现在已经报道的提取HBV聚合酶的方法主要有两种：质粒表达纯化法和肝组织直接提取法。质粒表达纯化的方法有大肠杆菌系统和杆状病毒-昆虫细胞系统。然而我们在文献调研的过程中发现，这种方法并不稳定，而且效率较低。此外，该方法得到的蛋白容易失活，这不利于我们后续实验的进行。为了得到活性稳定的HBV聚合酶，我们采取鸭肝组织直接提取的方法进行实验。

与HBV聚合酶不同，鸭肝中的聚合酶是DHBV聚合酶。但是，DHBV聚合酶与HBV聚合酶具有同源性(如图1)，且鸭子模型是研究乙肝药物的重要模型，阳性药拉米夫定在鸭子模型中具有很好的效果，因此我们认为可以使用DHBV聚合酶进行靶点的研究。

2.DHBV聚合酶测定方法的建立

DHBV聚合酶的检测方法主要有两种，即同位素标记法和非同位素标记法。同位素由于其本身的特殊性，该检测方法有以下几个弊端：(1)同位素具有很强的放射性，对人体产生很大的辐射作用，不适宜长期从事该方面工作。(2)国家对同位素的使用管理严格，只有国家批准的相关机构可以使用同位素，购买同位素还需要上报备案，程序繁琐，耗时长，限制了广大科研工作者的相关研究。

非同位素标记法主要是利用化学发光底物进行标记，通过最终的颜色反应检测酶活力的强弱。这种方法操作简单，毒性小，灵敏度高，普通实验室可行性强。目前尚未有文献报道利用非同位素标记法测定DHBV聚合酶活性。本发明选择非同位素标记法，建立了测定DHBV聚合酶活性的方法。该检测方法的原理是建立模板，将引物杂交到模板上，通过酶的活性反应将生物素标记的dUTP连接到引物上，利用免疫反应再将碱性磷酸酶/辣根过氧化物酶连接上去，最后通过发光反应使体系显色。检测方法见图2。

发明内容

本发明目的在于提供一种DHBV DNA聚合酶的提取方法，本发明的另一个目的在于提供一种DHBV DNA聚合酶检测的新方法，并提供用于该检测方法中部分液体的配方和该检测方法的实际用途。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

1.DHBV DNA聚合酶的提取方法

选取1～2日龄鸭子，腿静脉攻入含有DHBV的血清，使其感染DHBV。7日后取鸭肝，剪碎鸭肝，加入1:1体积的缓冲液Ⅰ，进行肝匀浆。将肝匀浆离心后取上层，上层再重新离心，取上层合并。离心管中加入5ml 30％蔗糖的缓冲液Ⅰ垫底，将所得肝匀浆上层物超速离心，去掉上清，沉淀加1～2ml缓冲液Ⅱ，静置12小时。配置15％～50％等八个浓度的缓冲液Ⅰ，按浓度从高到低缓慢加入离心管中，此时液体分层，放入4℃冰箱中12小时。上层加上沉淀溶解物，低温超速离心后，按浓度梯度层逐层取出，每层再低温超速离心7小时，所得沉淀加入缓冲液Ⅱ溶解，取35％和40％部分合并超速离心，溶解后-80℃保存，即得实验所需的DHBVDNA聚合酶。

2.DHBV DNA聚合酶活性测定方法

2.1 Oligo(dT)₁₅包被板的制备