[发明专利]一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法

权利要求书

1.一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、外植体的选择与处理：以5至7月份旺盛生长期植株的幼嫩叶片、茎和叶柄为外植体进行愈伤组织诱导，采回来的外植体先用流水冲洗干净，然后在超净工作台上用70％酒精浸泡消毒，叶片浸泡30-60秒，叶柄和茎浸泡2-3分钟，用无菌水冲洗2-4次，再用氯化汞消毒7-10min，无菌水冲洗2-4次，用无菌滤纸吸干水分，用解剖刀将叶片切割成约1cm²的正方形，叶柄和茎切割成0.2-0.5cm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基上；

S2、愈伤组织的诱导：以添加了2,4-D，蔗糖(30g/L)，琼脂(6.5g/L)的MS培养基为诱导培养基，叶片诱导愈伤的2,4-D浓度为0.5mg/L-1.0mg/l，茎和叶柄诱导愈伤的2,4-D浓度为1.0mg/L-3.0mg/L，愈伤组织的诱导条件：温度25±1℃，湿度60％-70％，暗培养10-15天后转至12h/12h(2000lx)光培养，5天后开始生成淡黄色、疏软的愈伤组织，30-45天后愈伤组织转至增殖培养基；

S3、愈伤组织的增殖培养：将愈伤组织在添加了0.5-1.0mg/L2,4-D和IBA(吲哚丁酸)的培养基上继代培养，每15天继代一次；培养条件为温度25±1℃，湿度：60％-70％，光12h/暗16h光周期,光照强度20001x。

S4、胚性愈伤组织的诱导：将增殖培养后约1g的愈伤组织转至诱导培养基上，诱导培养基以MS为基本培养基，添加IBA1.0-4.0mg/L、6-BA0.5-1.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，诱导条件为：温度25±1℃，湿度60％-70％，光8h/暗16h光周期，光照强度2000lx。

S5、胚性愈伤组织分瓶培养：在体细胞胚诱导培养基上培养10天后，愈伤组织会迅速增殖3-5倍，形成大的胚性愈伤组织团，将增殖后的愈伤组织平均分到新的培养基上继续培养，每瓶接种1-2g，愈伤组织平铺在培养基上，13天后开始出现体细胞胚；

S6、再生根培养：用解剖刀切取长2cm的不定芽扦插到再生根培养基上，生根培养基以WPM为基本培养基，添加IBA0.5-1.0mg/L，NAA0.2-1.0mg/L,蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，诱导条件为：温度25±1℃，湿度60％-70％，光12h/暗12h光周期，光照强度2000lx，45天后，体细胞胚发展成长势强的完整植株；

S7、驯化移栽：生根培养45天后，选择根系健壮，生长势强的植株进行驯化培养，首先将组培苗用镊子取出，用自来水冲洗干净根部基质，避免伤根，然后移栽到10×10cm营养钵中,营养土体积配比灭菌的田土：草炭土：蛭石为(1:1:1)，移栽后保持空气湿度80-90％防止组培苗叶片抽干，将组培苗置于原培养箱或组培室中培养，培养条件14h/10h光周期，温度25±1℃，光照强度2000lx，一周后，降低空气湿度至60-70％，2周后，将驯化后的组培苗转移至温室中培养，用遮阳网适当遮荫，遮盖塑料薄膜使空气湿度保持在60％-70％，30天后逐渐撤去遮阳网和塑料薄膜，统计成活率，移栽到露地中。

2.根据权利要求1所述的一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，其特征在于，所述S1中外植体的最佳选择为茎。

3.根据权利要求1所述的一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，其特征在于，所述叶片诱导愈伤的最佳2,4-D浓度为0.5mg/L，茎和叶柄诱导愈伤的最佳2,4-D浓度为1.0mg/L，培养条件为暗培养15天后转为光培养。

4.根据权利要求1所述的一种诱导愈伤组织增殖的方法，其特征在于，所述S3中IBA为0.5mg/L和2,4-D浓度为0.5mg/L，培养条件为温度25±1℃，湿度：60％-70％，光12h/暗12h光周期。

5.根据权利要求1所述的一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，其特征在于，所述S4中IBA浓度3.0mg/L，6-BA浓度为0.5mg/L，培养条件为温度25±1℃，湿度60％-70％，光8h/暗16h光周期。