[发明专利]一种检测禽腺病毒血清4型的引物组、试剂盒及其检测方法与应用在审
| 申请号： | 201910430677.1 | 申请日： | 2019-05-22 |
| 公开（公告）号： | CN110042176A | 公开（公告）日： | 2019-07-23 |
| 发明（设计）人： | 王红宁;翟熙雯;雷昌伟;梅雪然;吴暄 | 申请（专利权）人： | 四川大学 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93 |
| 代理公司： | 成都顶峰专利事务所(普通合伙) 51224 | 代理人： | 王霞 |
| 地址： | 610000 四*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 核苷酸序列 引物组 禽腺病毒 血清4型 内引物 试剂盒 外引物 种检测 异硫氰酸荧光素 等温扩增技术 快速检测技术 可视化检测 生物素标记 试剂盒操作 横向流动 基因设计 结合环 试纸条 检测 介导 引物 应用 灵敏 | ||
1.一种检测禽腺病毒血清4型的引物组，其特征在于：所述引物组包括外引物和内引物，其中外引物为F3和B3，内引物为FIP和BIP，所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述FIP为5端生物素标记的序列，所述BIP为5端异硫氰酸荧光素标记的序列。
2.一种检测禽腺病毒血清4型的LAMP-LFD试剂盒，其特征在于：包括扩增试剂、阳性对照品、阴性对照品、横向流动试纸条以及如权利要求1所述的引物组，所述阳性对照品为禽腺病毒SC-Neijiang，所述阴性对照品为双蒸水。
3.根据权利要求2所述的检测禽腺病毒血清4型的LAMP-LFD试剂盒，其特征在于：所述扩增试剂包括浓度为10×的Isothermal Amplification Buffer、浓度为8000U/mL的Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶、浓度为10mmol/L的dNTPs MIX和浓度为100mmol/L的MgSO4。
4.根据权利要求3所述的检测禽腺病毒血清4型的LAMP-LFD试剂盒，其特征在于：所述浓度为10×的Isothermal Amplification Buffer中包含浓度为200mmol/L的Tris-HCl、浓度为100mmol/L的(NH4)2SO4、浓度为500mmol/L的KCl、浓度为20mmol/L的MgSO4和体积百分数为0.1％的Tween 20，所述Isothermal Amplification Buffer的pH为8.8。
5.一种用权利要求2-3任意一项所述的LAMP-LFD试剂盒检测禽腺病毒血清4型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取待测样品的DNA；
S2、准备LAMP-LFD反应体系；
S3、将步骤S2中反应体系配制于PCR管中，同时设置阳性对照组和阴性对照组；
S4、LAMP-LFD扩增反应：将含有反应体系的PCR管混匀后离心，进行扩增反应，获得反应液；
S5、从反应液中吸取8μl杂交液加入到100μl Buffer中混匀，将LFD试纸条浸入其中，反应5分钟后读取检测结果。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤S4中扩增反应的反应条件为，65℃恒温反应40min。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤S2中LAMP-LFD反应体系的体积为25μl；反应体系中各组分的加样量分别为：10×的Isothermal Amplification Buffer为2.5μl，100mmol/L的MgSO4为1μl，10mmol/L的dNTPs MIX为3μl，8000U/mL的Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶为1μl，10μmol/L的F3和B3各为0.5μl，10μmol/L的FIP和BIP各为4μl，样品DNA为2μl，双蒸水6.5μl。
8.一种权利要求1所述的引物组在检测禽腺病毒血清4型或制备LAMP-LFD试剂盒中的应用。
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