[发明专利]一种牛病毒性腹泻病毒的乳胶凝集检测方法及应用

说明书

本发明提供了一种牛病毒性腹泻病毒抗体检测方法，该方法使用乳胶凝集试验方法及应用。利用碳化二亚胺将经原核表达纯化产物E0蛋白偶联到羧化乳胶微球上，由此建立了一种牛病毒性腹泻快速检测方法—乳胶凝集检测方法。该方法操作简便、对设备要求低、特异性强、灵敏度高、检测快速等优点。

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，涉及免疫学、化学相关领域。具体是一种牛病毒性腹泻病毒抗体乳胶凝集检测方法及应用。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）属于黄病毒科（Flaviviridate）瘟病毒属（Pestivirus）成员，可引发牛病毒性腹泻，又称牛病毒性腹泻/黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease, BVD-MD）。该病毒可导致牛及其他反刍动物病毒性腹泻，对繁殖系统、消化系统、免疫系统及产奶量等造成严重影响，给养殖业造成巨大的经济损失，影响畜牧行业的发展。我国有研究调查表明，检测结果有超过46.7%的牛场为牛病毒性腹泻病毒抗原阳性，其中牛群中2.2%的牛只为持续性感染牛（PI），在亚洲我国牛病毒性腹泻感染程度远高于多数其他国家，同时普遍感染率也高于欧美国家。与此同时，病毒基因亚型也在增加。我国大多数省份已被报道感染此病，在山东、内蒙、北京、宁夏、青海及东北等地区，抗体阳性率分别是66.3%、88.9%、93.4%、90.2%、21.14%及23.5%。欧美及澳洲国家对此病进行有效控制，甚至有些国家已经消灭该病在该国家的流行。牛病毒性腹泻病毒是一种引起世界范围内牛及其他反刍动物传染性疾病的重要病原，造成巨大的经济损失。迄今为止世界上并没有针对该病的特效药，常用方法是通过疫苗接种，结合检疫淘汰手段进行该病的消除。我国需要提高该病的受重视程度，制定相关防控措施，检测及淘汰PI牛，提高广大养殖户的认知程度，控制该病的传播，全面综合防控牛病毒性腹泻病。

乳胶凝集试验（LAT）是以惰性载体表面吸附特定的抗原或抗体，通常以聚苯乙烯乳胶颗粒为载体，以一定的手段吸附抗原或抗体，结合后的乳胶抗原或乳胶抗体再与相应的抗体或抗原作用时，能反应生成人眼可视的凝集微团颗粒。本申请人克服普通乳胶与抗原易脱落的困难，选用带有羧基基团（-COOH）的聚苯乙烯乳胶微球为载体，利用水溶性的碳化二亚胺将E0蛋白偶联到乳胶微球表面，经化学反应制备的乳胶抗原液更加稳固，结合率高，不易脱落。由于检测过程操作简便，价格低廉，不需要特殊的仪器，肉眼即可判断，简单易学，检测过程耗时短，适合基层养殖场人员操作。

发明内容

本发明的目的在于提供了在乳胶抗原制备过程中所需的特异性抗原牛病毒性腹泻病毒E0蛋白。

本发明的目的在于提供一种牛病毒性腹泻病毒抗体乳胶凝集检测方法，该方法操作简便，基层人员容易掌握。

本发明技术方案的优点在于：特异性强，灵敏度高，检测时间短，测试结果客观合理可信度高。

为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：

本试验对pET-32a-E0进行诱导表达，对诱导条件（时间、温度及IPTG浓度）进行优化，并利用SDS-PAGE分析了重组蛋白的表达形式，最后使用His标签亲和镍柱层析对表达的蛋白进行纯化和免疫印迹检测；利用碳化二亚胺（EDC）活化羧化乳胶微球备用；以该蛋白E0致敏活化后的羧化乳胶，制备乳胶抗原诊断试剂备用；取30μL乳胶抗原液分别与等体积阳性血清、阴性血清混匀后，等待2～3min，观察结果，并判定：“++++、+++、++、+、-”。

采用上述技术方案，本发明具有的有益效果为：

本发明提供了一种牛病毒性腹泻病毒抗体乳胶凝集检测方法，利用E0蛋白作为诊断抗原制备乳胶抗原液来检测牛病毒性腹泻病毒，E0蛋白具有良好的特异性和反应原性。制备的抗原乳胶液具有特异性强，灵敏度高，且不发生自凝，。该方法操作简单快速，无需昂贵设备，适合基层人员的使用。

附图说明