[发明专利]一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法

说明书

本发明涉及一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法。所述方法为：抽取健康人的外周血，分离淋巴细胞，在无血清培养基中用唑来膦酸和白细胞介素2，白细胞介素15联合刺激，分别在刺激的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有细胞因子的新鲜培养基。在培养3‑15天后，加入白细胞介素12和细胞介素18联合刺激12‑72小时，能够有效扩增并增强Vγ2Vδ2 T细胞对胞内感染分枝杆菌的抑制或杀灭效果。该类细胞可以用于临床结核病及相关感染性疾病以及肿瘤的细胞免疫治疗。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法。

背景技术

结核病tuberculosis(TB)是由结核分枝杆菌及其复合菌群感染引起的传染病。由于结核病的现有唯一预防性疫苗BCG的保护效果不理想，HIV与TB的共感染，以及耐多药结核病的出现等问题，使得目前结核病的防治依然面临严峻的挑战。耐多药结核病是指结核病人体内的病原菌对多种临床使用的抗结核药物产生了耐药性。目前，耐多药结核病是结核病治疗过程中面临最大的问题。现在所有的临床抗结核化学药物都发现了耐药菌株，耐多药结核病面临无药可用的地步。目前尚无新型抗结核化学药物问世，因此需要开发新型的治疗方法来治疗结核病。

结核分枝杆菌是胞内寄生菌，细胞免疫在抵抗结核菌感染过程中发挥重要作用。结核病的细胞免疫治疗可以诱发宿主特异性免疫应答，来杀死细胞内寄生的结核分枝杆菌。免疫治疗和化学药物的联合使用为结核病的治疗提供了新思路，尤其为耐药结核病的治疗开辟了新途径。

Vγ2Vδ2 T细胞又名Vγ9Vδ2 T细胞，占人体外周血细胞约1-10％、γδ T细胞的90％左右，在人体先天性免疫和后天免疫中发挥重要作用。我们前期的大量研究证明，Vγ2Vδ2 T细胞具有临床用于结核免疫治疗的潜力。Vγ2Vδ2 T细胞是唯一能够识别结核磷酸抗原的γδT细胞，只存在于人和非人灵长类，其它动物不存在这种抗原特异的γδT细胞。我们建立了体内靶向扩增Vγ2Vδ2 T细胞的方法，并证明Vγ2Vδ2 T细胞靶向免疫治疗对猴结核病有显著的治疗效果。但目前未见体外高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞用于TB治疗的报道。

期刊《郑州大学学报：医学版》2011年第4期刊出的文章“中国猕猴CD4+CD25+调节性T细胞对Vγ2Vδ2T细胞体外增殖的影响”，公开了IL-2联合HMBPP可体外预激活Vγ2Vδ2T细胞。专利文献CN103555666A，公开日2014.02.05，公开了一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法，应用IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼体外诱导Vγ9Vδ2T细胞的生成，得到了诱导效率更高及活性更高的Vγ9Vδ2T细胞。但仍需要更高效的Vγ2Vδ2 T细胞扩增活化方法，尤其是提高Vγ2Vδ2 T细胞抗结核效应功能的方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞，提高Vγ2Vδ2 T细胞抗结核效应功能的方法。

第一方面，本发明提供了高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞的方法，包括以下步骤：将新鲜分离的外周淋巴细胞使用含0.75-15μg/ml唑来膦酸、5-100ng/ml IL-2、10-200ng/mlIL-15的培养体系进行培养，其中，分别在刺激的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基。

作为一个优选例，在使用所述培养体系培养3-15天后，向培养体系中加入50-200ng/ml IL-12和50-200ng/ml IL-18，继续培养12-72小时。

作为另一优选例，所述培养体系使用的培养基为X-VIVO 15免疫细胞无血清培养基或含10％胎牛血清的1640培养基。

作为另一优选例，培养后，还包括对Vγ2Vδ2 T细胞分离的步骤。

作为另一优选例，所述外周淋巴细胞是采用Ficoll分离方法获得的。