[发明专利]一种基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针的制备方法及应用

权利要求书

1.一种基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针，其特征在于，化学结构式为：

；

所述荧光探针由如下制备方法制得：

（1）制备HBMA单体，备用；

（2）制备苄基三硫代碳酸酯 BTPA，备用；

（3）PEG大分子链转移剂的制备：

A、将PEG₁₁₃-OH 溶解在无水甲苯中，在减压条件下共沸蒸馏以除去大部分溶剂，得溶液A；然后将无水二氯甲烷倒入干燥的 BTPA中溶解，得溶液B；将溶液B和溶液A混合后，得溶液C，放置于冰水浴中；

B、将4-二甲氨基吡啶DMAP和 N,N-二环己基碳二亚胺DCC溶解于二氯甲烷中，得溶液D，将溶液D滴加到上述溶液C中；在室温下反应结束后，过滤溶液，将所得滤液浓缩，并用过量的冷乙醚沉淀，将获得的沉淀物溶解在无水CH₂Cl₂ 中，蒸发浓缩后，沉淀到冷乙醚中，重复上述步骤，收集淡黄色的固体，即聚乙二醇单甲醚的大分子链转移剂，即PEG大分子链转移剂；

PEG大分子链转移剂：Mn=6.1KDa, Mw/Mn=1.06；PEG₁₁₃-b-P(NIPAM-co-HBMA)_m：Mn=15.5KDa, Mw/Mn=1.21；PEG₁₁₃-b-P(NIPAM-co-HBMA)_m-P1：Mn=16.0 KDa, Mw/Mn =1.23；

（4）温敏嵌段聚合物PEG₁₁₃-b-P(NIPAM-co-HBMA)_m的制备，简称TBC；

将步骤（3）制备的PEG大分子链转移剂，N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于1,4-二氧六环，再加入步骤（1）制备的HBMA单体，混合液经过三次“冷冻-抽气-融化”循环后在真空下密封，油浴中反应后，该聚合反应在液氮中淬灭，打开封管，用1,4-二氧六环稀释溶解，混合物在过量的乙醚中沉淀，取出沉淀物，重复上述稀释溶解-沉淀循环，得到浅黄色的粉末状固体，温敏嵌段聚合物PEG₁₁₃-b-P(NIPAM-co-HBMA)m，简称TBC；

（5）配制温敏嵌段聚合物PEG₁₁₃-b-P(NIPAM-co-HBMA)_m溶液

将步骤（4）制备的温敏嵌段聚合物溶解于Tris-HCl 的缓冲溶液中，得到温敏嵌段聚合物溶液；

（6）温敏聚合物荧光探针PEG₁₁₃-b-P(NIPAM-co-HBMA)_m-P1的制备，简称TBC-P1；

将荧光基团标记的寡核苷酸P1贮存液与步骤（5）制得的温敏嵌段聚合物溶液混合，并于室温下恒温振荡，反应结束后，置于恒温水浴锅中升温直到沉淀，然后离心去除未固定的寡核苷酸序列，将得到的沉淀分散于Tris-HCl缓冲溶液中，混合均匀后室温下保存，制备得到基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针PEG₁₁₃-b-P(NIPAM-co- HBMA)_m-P1储备液。