[发明专利]一种检测towneri不动杆菌的特异性引物及方法和应用

说明书

本发明公开了一种检测towneri不动杆菌的特异性引物及方法和应用，所述的特异性引物如SEQ ID NO.1～2所示，通过提取待测样品基因组DNA，使用上述引物进行PCR扩增，凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，存在401bp的DNA特异性条带，则确定样品中含有towneri不动杆菌。采用本发明的检测方法检测towneri不动杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度较高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种检测towneri不动杆菌的特异性引物及方法和应用。

背景技术

不动杆菌(Acinetobacter)是一种不发酵葡萄糖的革兰阴性球杆菌，种属众多，广泛分布于自然界的水、土壤及皮肤表面。之前研究表明大部分不动杆菌是从医院临床分离得到的医院源不动杆菌，也有报道说不动杆菌是引起医院感染的重要条件致病菌之一，常见于呼吸机相关肺炎、菌血症、伤口感染等，平时定植于机体宿主上，当机体免疫功能低下时，定植的不动杆菌就可能侵入其它部位造成感染。而从近十年的研究来看，不动杆菌逐渐从人源转移到了动物源，并且除了鲍曼不动杆菌，不动杆菌其他种可能致病的不动杆菌分离率也在逐年上升，这不仅丰富了动物体混合感染细菌的种类，同时也给予了我们一定的警示，医源性的病原感染动物的情况，具有临床兽医关注的价值。本实验室首次从临床症状为呼吸道疾病的病死牛种分离到对小鼠有致死作用的牛源towneri不动杆菌，表明该菌可能成为肉牛感染致死的主要致病菌或继发感染病原菌，应引起兽医临床上预防和治疗的高度重视，因此建立牛源towneri不动杆菌的快速特异性PCR诊断方法，为后续研究该菌的快速诊断和治疗防控提供技术支撑是非常有必要的。

传统上的细菌鉴定方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，需要大量的时间进行生理生化反应的结果判读，不利于及时诊断病因，查找病原，控制病情蔓延。而诸如16SrRNA测序等手段，不适用于常规检测。PCR技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，已逐步应用于细菌的快速检测。经对现有技术的文献检索发现，尚未有人发明与本发明的towneri不动杆菌PCR检测方法、核酸及引物相关报道。本发明建立的检测方法可运用于临床上对towneri不动杆菌快速诊断和流行病学调查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种towneri不动杆菌PCR检测引物及方法。该引物可用于towneri不动杆菌的PCR检测，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判读，实用性强。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种检测towneri不动杆菌的特异性引物，所述的特异性引物具体为：

正向引物F：5’-GACTGAGCCCGTAGAAGA-3’；

反向引物R：5’-ACAGTTGATTACCCACCC-3’。

在本发明的另一方面，提供了一种检测towneri不动杆菌的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品基因组DNA；

2)使用上述引物进行PCR扩增；

3)凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，存在401bp的DNA特异性条带，则确定样品中含有towneri不动杆菌。

进一步，所述的样品基因组利用TE缓冲液水煮法提取。

进一步的，所述的PCR扩增反应体系为25μL：2×TSINGKE Master Mix(blue)10μL，引物对2μL，模板DNA 2μL，双蒸水补至25μL。

进一步的，所述的PCR扩增反应程序为：96℃预变性7min；进入循环，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，降温12℃，结束。