[发明专利]一种运用绝缘子组合构建的慢病毒多启动子稳定表达载体及构建方法

说明书

本发明涉及一种运用绝缘子组合构建的慢病毒多启动子稳定表达载体及构建方法，属于生物医学工程技术领域。其将绝缘子IS22·3和绝缘子IS2整合入慢病毒载体；所述IS22·3的序列如SEQ ID No.1所示；所述绝缘子IS2的序列如SEQ ID No.2所示。所述慢病毒载体为用于RNA干扰实验的慢病毒载体。本发明针对现有慢病毒载体功能方面的某些空白，将绝缘子IS22·3和IS2整合入慢病毒载体，一方面可以隔离启动子间的相互干扰，另一方面可以防止基因沉默。这样既可以实现多基因表达又可以保障其表达的稳定性。

技术领域

本发明涉及一种运用绝缘子组合构建的慢病毒多启动子稳定表达载体及构建方法，属于生物医学工程技术领域。

背景技术

慢病毒载体(Lentiviral vector，LV)由于其可有效转染多种类的细胞，尤其可以非分裂细胞，受到研究者普遍青睐。目前成为外源性基因转移的有效载体，被广泛应用于基础实验研究和基因治疗领域。

真核生物在发育和生长过程中存在着基因有序的开放和关闭，这一过程中基因组的特定基因或基因簇在不同时间、不同空间的特异性表达。决定上述过程的除了顺式作用元件、反式作用元件等基因转录调节因子，启动子是根本元件。因为启动子是转录调控因子作用的靶点。因此，将不同的启动子同时整合入慢病毒实现多基因的表达无论在实验研究还是在基因治疗均有其现实意义。

二十多年以来慢病毒载体不断改进从第一代发展到第三代，成为了安全有效的载具。但是因为外源基因插入基因组DNA的随机性，其稳定表达和多基因转染方面鲜有突破。尽管在腺病毒有科学家尝试构建包含多启动子载体，据报道收到比较满意的效果，但就慢病毒而言多次的努力均因启动子间的相互干扰影响其表达功能而未能如愿，更谈不上这方面的商业性载体。

绝缘子是真核生物基因组DNA内固有的特殊序列，诸如CCCTC binding factor(CTCF)可以与其结合，从而隔绝调控元件干扰和染色质凝聚，维持基因表达的基本稳定性。基因组中另一种结构：核基质附着区(SARs/MARs，scaffold/ matrix attachmentregions)也具有屏障活性，使染色质形成独立的环状结构，防止启动子逐渐失活。SAR序列是顺式调控元件，MARs是指能够与核基质(nuclear matrix)特异性结合的DNA序列。结合区域被识别并命名为SAR/MAR识别特征(SAR/MAR recognition signature，MRS)。

绝缘子IS2是Francisco Martin等研究、设计并验证的一种嵌合的绝缘子，由鸡β珠蛋白基因调控区具有绝缘子特点的cHS4的核心序列HS4-650和合成的 SAR元件(SAR2，包含4MRS)组合而成，命名为IS2(Francisco Martin,Karim Benabdellah,et al.A chimericHS4-SAR insulator(IS2)that prevents silencing and enhances expression oflentiviral vectors in pluripotent stem cells[J].PLoS ONE, 2014,9(1):e84268.)。基于IS2他们开发了具有IS2保护下的SFFV启动子的慢病毒蛋白表达载体；而且IS2对聚合酶ⅢRNA启动子也有同样的保护作用 (Linsong Yang,Fang Wang,Xuzhang Lu,Min Zhou,Chunyan Ye,Yiwu Sun.The influence of a chimeric insulator on thestabilization of shRNA expression transfected by lentivirus.Life ScienceJournal，2019；16(5)：19-25)。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种运用绝缘子组合构建的慢病毒多启动子稳定表达载体及构建方法，其一方面可以隔离启动子间的相互干扰，另一方面可以防止基因沉默；既可以实现多基因表达，又可以保障其表达的稳定性。