[发明专利]猪流行性腹泻病毒无标记的阻抗型免疫传感器及其制备方法

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒无标记的阻抗型免疫传感器，其特征在于，是将猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体PEDV-2C11固定于纳米金/二硫化钼/还原石墨烯复合纳米材料修饰的电极表面而构建制得，具体步骤如下：

（1）金胶的制备：制备金纳米粒子溶液；

（2）纳米金/二硫化钼/还原石墨烯复合材料的合成

首先，合成二硫化钼/还原石墨烯：在10 mL去离子水中加入0.08 g Na₂MO₄•2H₂O和6 mg氧化石墨烯，超声分散10 min；加入0.126 g硫脲溶解，将所得混合物超声处理30 min后转移到10 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中；将高压釜放入烘箱加热至200 ℃并保持24 h，冷却至室温；以6000 rpm/min的速度离心5 min收集所得黑色沉淀物，用水和乙醇洗涤数次，然后在60 °C下干燥；在反应过程中，氧化石墨烯被转化为还原的氧化石墨烯；随后，将10 mg MoS₂/rGO添加到10 mL已制备好的金纳米溶液中，在室温下振荡12 h，所得AuNPs/MoS2/rGO复合材料用水洗涤后6000 rpm/min离心5 min得到沉淀物，在60 ℃下干燥收集最终产物；

（3）免疫传感器的制备

用直径为0.15 μm的Al₂O₃抛光液将GCE表面打磨成镜面后，用超纯水进行超声清洗并在氮气流中干燥，待电极完全干燥后，将5 μL AuNPs/MoS₂/rGO水溶液滴到裸GCE表面，室温晾干；

将修饰好的电极浸入200 µL 0.15 mg/mL单克隆抗体PEDV-2C11的磷酸盐缓冲溶液中，置于4°C下12 h，电极取出后放入 10 mg/mL 的牛血清蛋白中1 h以封闭非特异性位点；用二次水冲洗除去表面多余的牛血清蛋白，制备好的电极浸入pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，置于4°C保存备用；

将固定了抗体的电极浸入不同浓度猪流行性腹泻病毒的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，置于 37.5°C水浴中反应 140 min后，取出分别用二次水和磷酸缓冲溶液冲洗干净，然后进行电化学阻抗检测。

2.权利要求1所述猪流行性腹泻病毒无标记的阻抗型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）金胶的制备：制备金纳米粒子溶液；

（2）纳米金/二硫化钼/还原石墨烯复合材料的合成

首先，合成二硫化钼/还原石墨烯：在10 mL去离子水中加入0.08 g Na₂MO₄•2H₂O和6 mg氧化石墨烯，超声分散10 min；加入0.126 g硫脲溶解，将所得混合物超声处理30 min后转移到10 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中；将高压釜放入烘箱加热至200 ℃并保持24 h，冷却至室温；以6000 rpm/min的速度离心5 min收集所得黑色沉淀物，用水和乙醇洗涤数次，然后在60 °C下干燥；在反应过程中，氧化石墨烯被转化为还原的氧化石墨烯；随后，将10 mg MoS₂/rGO添加到10 mL已制备好的金纳米溶液中，在室温下振荡12 h，所得AuNPs/MoS2/rGO复合材料用水洗涤后6000 rpm/min离心5 min得到沉淀物，在60 ℃下干燥收集最终产物；

（3）免疫传感器的制备

用直径为0.15 μm的Al₂O₃抛光液将GCE表面打磨成镜面后，用超纯水进行超声清洗并在氮气流中干燥，待电极完全干燥后，将5 μL AuNPs/MoS₂/rGO水溶液滴到裸GCE表面，室温晾干；

将修饰好的电极浸入200 µL 0.15 mg/mL单克隆抗体PEDV-2C11的磷酸盐缓冲溶液中，置于4°C下12 h，电极取出后放入 10 mg/mL 的牛血清蛋白中1 h以封闭非特异性位点；用二次水冲洗除去表面多余的牛血清蛋白，制备好的电极浸入pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，置于4°C保存备用；

将固定了抗体的电极浸入不同浓度猪流行性腹泻病毒的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，置于 37.5°C水浴中反应 140 min后，取出分别用二次水和磷酸缓冲溶液冲洗干净，然后进行电化学阻抗检测。