[发明专利]脐血造血干细胞保存液及其制备方法

权利要求书

1.一种脐血造血干细胞保存液，其特征在于：按重量份数计，原料包括：10-18份低分子右旋糖酐、6-18份二甲基亚砜、65-80份DMEM培养基、4-8份甘油、0.05-0.2份叶酸、0.1-0.5份甘露低聚糖和1-5份磷脂酰丝氨酸；

所述二甲基亚砜、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸的重量比范围为20-30:1:8-15；

所述脐血造血干细胞保存液的制备与预处理方法包括以下步骤：将配方用量二甲基亚砜、低分子右旋糖酐、DMEM培养基、甘油、叶酸、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸混匀后，即得保存液，将保存液进行两段变温预处理，而后冷却平衡，所述两段变温预处理包括第一段降温处理与第二段升温处理；

所述第一段降温处理，处理温度为-15~-8℃，处理时间为10-15min；所述第二段升温处理，处理温度为4℃，处理时间为5-10min。

2.根据权利要求1所述的脐血造血干细胞保存液，其特征在于：按重量份数计，原料包括：12-16份低分子右旋糖酐、8-15份二甲基亚砜、70-78份DMEM培养基、5-7份甘油、0.08-0.15份叶酸、0.2-0.4份甘露低聚糖和2-4份磷脂酰丝氨酸。

3.一种脐血造血干细胞的分离、培养和保存方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）脐血造血干细胞的分离与培养：

①采集脐血，向脐血中加入羟乙基淀粉冲洗并混匀，进行三次降温离心，每一次降温离心后均收集上层含有白细胞的血浆层，将三次降温离心后收集到的血浆层混匀，经PBS缓冲液冲洗后得到造血干细胞；

②将DMEM培养基与羟乙基淀粉加入步骤①得到的造血干细胞中，混匀后沉降，取上清液吹打混匀，得到白细胞悬液；

③将DMEM培养基加入步骤②中的白细胞悬液中，调节白细胞终浓度为0.5×10⁶/mL；

④将CFU-GM半固体培养基加入培养板内，培养板外围加入生理盐水，再将培养板放入CO₂培养箱中静置；

⑤将步骤③中调好浓度的白细胞悬液加入培养板中的CFU-GM半固体培养基中，将培养板放入CO₂培养箱中培养后得到造血干细胞集落；

（2）保存液的制备与预处理：采用如权利要求1或2所述的脐血造血干细胞保存液的制备与预处理方法；

（3）造血干细胞的保存：将步骤（1）中的造血干细胞集落冷却平衡后与保存液混匀。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤①中所述脐血与羟乙基淀粉的体积比为4:1。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤①中所述三次降温离心的第一次降温温度为4-10℃，转速为480rpm，时间为5-8min。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤①中所述三次降温离心的第二次降温离心和第三次降温离心的温度均为4-10℃，转速均为1500rpm，时间均为4-6min。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述冷却平衡，时间为5-15min，温度为4℃以下。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述冷却平衡，时间为10-15min，温度为4℃。