[发明专利]一种提高木糖酸脱水酶活性的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种提高木糖酸脱水酶活性的基因工程菌，其特征在于，构建克隆表达铁硫簇插入蛋白SufA基因， 并将构建好的基因转入宿主菌内得基因工程菌，所述基因工程菌用于发酵生产D-1 ,2 ,4-丁三醇的中间产物2-酮基-3-脱氧-d-木糖酸，所述的铁硫簇插入蛋白SufA基因来自大肠杆菌MG1655，且核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；用于扩增SufA基因的引物的正向引物如SufA-EcoR I-F所示：CCGGAATTCCGGATGGACATGCATTC，

反向引物如SufA-Kpn I-R所示：CGGGGTACCCCGTTAGCTAAGTGCAG；

所述的木糖酸脱水酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述的宿主菌为大肠杆菌Trans 1 T1，所述提高木糖酸脱水酶活性的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：步骤1，将木糖酸脱水酶基因的两端插入酶切位点NcoⅠ与Hind Ⅲ，然后将酶切后的木糖酸脱水酶基因克隆到质粒一中，得到重组质粒一；将铁硫簇插入蛋白SufA基因的两端插入酶切位点EcoRⅠ与KpnⅠ,然后将酶切后的铁硫簇插入蛋白SufA基因克隆到质粒二中；得到重组质粒二；步骤2，将重组质粒一和重组质粒二共同转入宿主菌内，即得到了基因工程菌E.coliT1-pCWJ-yjhG-pTRC99A-SufA其中，质粒一为pCWJ质粒，质粒二为pTRC99A质粒。

2.基于权利要求1所述的提高木糖酸脱水酶活性的基因工程菌在以D-木糖酸为底物产1,2，4-丁三醇上的应用，其特征在于，包括如下步骤：第一步，培养基因工程菌E.coliT1-pCWJ-yjhG-pTRC99A-SufA；第二步，收培养后的基因工程菌，接种到发酵培养基中，加入D-木糖酸和IPTG诱导反应体系发酵产D-1,2,4-丁三醇，所述的反应体系包括如下组分：D-木糖酸的添加量为20g/L，菌体OD₆₀₀为60，置于33℃摇床反应17h。