[发明专利]一种提高木糖酸脱水酶活性的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种提高木糖酸脱水酶活性的基因工程菌及其构建方法与应用，构建克隆表达铁硫簇插入蛋白SufA，并将构建好的基因转入宿主菌细胞内得基因工程菌，所述基因工程菌用于发酵生产D‑1,2,4‑丁三醇的中间产物2‑酮基‑3‑脱氧‑d‑木糖酸。通过提高了木糖酸脱水酶的活性，进而促进了木糖酸的消耗并提高了2‑酮基‑3‑脱氧‑d‑木糖酸的产量，最后提高了D‑1，2，4‑丁三醇的发酵生产。本发明方法简单，可靠性强，应用前景广。

技术领域

本发明涉及2-酮基-3-脱氧-d-木糖酸的制备技术领域，具体涉及一种提高木糖酸脱水酶活性的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

SufA、HscB、ScdA蛋白属于涉及铁-硫簇生物合成的复杂蛋白质机器。它们被定义为支架蛋白，预组装的簇从其转移至靶载脂蛋白。

铁硫蛋白是最古老，高度保守的大分子之一。 它们在多种生物过程中起作用，包括铁稳态，电子转移，氧化还原和非氧化还原催化，固氮，基因表达调节和氧物种检测。尽管近年来生物[Fe-S]簇的化学反应性和光谱性质已被广泛表征，但其生物合成的机制尚处于探索的早期阶段。实际上，生物合成过程中，确定比例的铁和硫原子从其储存源中被动员并以受控方式组合以产生各种[Fe-S]簇，这需要复杂的蛋白质机制。

D-木糖酸脱水酶，系统命名是D-木糖酸氢-裂解酶，能催化木糖酸脱水反应。属于IlVD/EDD蛋白质家族，IlvD指支链氨基酸生物合成途径中的脱水酶，EDD指Entner-Doudoroff途径中的脱水酶，其代替一些细菌中的经典糖酵解。据报道，属于IlvD / EDD家族的酶在蛋白质结构中含有[2Fe-2S]或[4Fe-4S]簇，并且D-木糖酸脱水酶一直存在底物消耗缓慢的缺点，由于铁和硫原子无法在生物合成过程中从其储存源中被动员起来，因此在细胞反应过程中底物消耗缓慢添加一些有利于铁硫簇参与反应的操纵子系统的蛋白，以此来提高催化效率。

2-酮基-3-脱氧-d-木糖酸为生产D-1 ,2 ,4-丁三醇的中间产物，也是木糖酸脱水酶以木糖酸为底物时的产物，也是产D-1 ,2 ,4-丁三醇第三个酶的底物。通过提高了木糖酸脱水酶的活性，进而促进了木糖酸的消耗并提高了2-酮基-3-脱氧-d-木糖酸的产量，最后提高了D-1，2，4-丁三醇的发酵生产。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高木糖酸脱水酶活性的基因工程菌及其构建方法与应用，该工程菌构建方法简单，能够产生有利于铁硫簇参与反应的操纵子系统的蛋白，提高了木糖酸脱水酶的活性，并进一步提高了D-木糖酶脱水酶对底物的消耗，最后可用于产丁三醇的领域。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种提高木糖酸脱水酶活性的基因工程菌，构建克隆表达铁硫簇插入蛋白SufA基因，并将构建好的基因转入宿主菌内得基因工程菌，所述基因工程菌用于发酵生产D-1 ,2,4-丁三醇的中间产物2-酮基-3-脱氧-d-木糖酸。

作为改进的是，所述的铁硫簇插入蛋白SufA基因来自大肠杆菌MG1655，且核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的木糖酸脱水酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作为优选，所述的宿主菌为大肠杆菌Trans 1 T1。

上述提高木糖酸脱水酶活性的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：步骤1，将木糖酸脱水酶基因的两端插入酶切位点NcoⅠ与Hind Ⅲ，然后将酶切后的木糖酸脱水酶基因克隆到质粒一中，得到重组质粒一；将铁硫簇插入蛋白SufA基因的两端插入酶切位点EcoRⅠ与KpnⅠ,然后将酶切后的铁硫簇插入蛋白SufA基因克隆到质粒二中；得到重组质粒二；步骤2，将重组质粒一和重组质粒二共同转入宿主菌内，即得到了基因工程菌E.coliT1-pCWJ-yjhG-pTRC99A-SufA。

作为改进的是，质粒一为pCWJ质粒，质粒二为pTRC99A质粒。