[发明专利]检测登革病毒的引物、探针、试剂盒和RT-iiPCR方法

说明书

本发明属于分子生物学检测领域，公开了检测登革病毒的引物、探针、试剂盒和RT‑iiPCR方法。所述引物和探针的序列为SEQ ID NO.1～3。所述试剂盒包括所述引物和探针，还包括四种核苷酸、阳性质控物、阴性质控物、镁离子缓冲液、反转录酶和taq DNA聚合酶，所述四种核苷酸为dATP、dGTP、dCTP和dUTP。所述检测方法包括以下步骤：提取样品RNA；在热对流PCR管中加入所述样品RNA和使用所述的试剂盒，通过热对流PCR检测设备进行检测。所述检测方法的特异性好，灵敏度高，还具有简便、快速和实用的特点，满足现场和野外环境下对登革病毒的检测需要。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及用于检测登革病毒的引物、探针、试剂盒和RT-iiPCR方法。

背景技术

登革病毒(Dengue Virus，DENV)属于黄病毒科黄病毒属，是一种经蚊媒传播引起的正链RNA病毒。

登革病毒感染后可导致隐性感染、登革热、登革出血热和登革休克综合征，后两种疾病状况的死亡率较高。典型的登革热患者，其临床表现有起病急骤，高热，头痛，肌肉与骨关节剧烈酸痛，部分患者会出现皮疹、出血倾向、淋巴结肿大、白细胞计数减少、血小板减少等。登革热因蚊虫为传播媒介，主要在热带和亚热带地区广泛流行，我国的广东和香港澳门等地也属于流行区，一般每年的7～9月份为高峰发病期。登革热有时会发展成大范围的暴发疫情，对社会经济活动和人民生活健康造成巨大影响。

国际间人员的频繁流动使得登革病毒的传播更为广泛，让疾控和检疫部门的传染病监测和防控面临诸多压力。

因此，需要建立一种能应用于现场甚至野外的登革病毒的核酸检测方法，这对于病原检出和提高疫情应对能力具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出检测登革病毒的引物、探针、试剂盒和RT-iiPCR方法。所述检测方法的特异性好，灵敏度高，还具有简便、快速和实用的特点，满足现场和野外环境下对登革病毒的检测需要。

一种检测登革病毒引物和探针，包括：

两条检测登革病毒的引物，其序列为

正向引物：5’-GCTYAACRYAGTKCTRACAGTTT-3’，(SEQ ID NO.1)

反向引物：5’-CTCDCGCGTTTCAGCATATTGA-3’，(SEQ ID NO.2)

一条检测登革病毒的探针，其序列为

探针：5’-ATTAGAGAGCAGATYTCTGRWRAAC-3’；(SEQ ID NO.3)

所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团。

所述引物和探针中Y、R、K、D和W的含义为：R＝A/G，Y＝C/T，K＝G/T，W＝A/T，D＝A/G/T。

优选的，所述荧光基团为FAM、TET、HEX、CY3或JOE。

优选的，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse。

一种检测登革病毒的试剂盒，包括上述的引物和探针。

优选的，所述试剂盒还包括四种核苷酸、阳性质控物、阴性质控物、镁离子缓冲液、反转录酶和taq DNA聚合酶，所述四种核苷酸为dATP、dGTP、dCTP和dUTP。

更优选的，所述阴性质控物为TE缓冲液或超纯水。所述TE缓冲液由Tris和EDTA配置而成，配置用水为无核糖核酸酶的超纯水。